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【分析必读】药物分析逃不过的色谱知识——色谱总论、气相色谱56个核心知识点(上)
发表于:2019-09-16 浏览:676

  本篇药研分析的文章共分为了四个部分:色谱法总论、气相色谱法、高效液相色谱、质谱分析法,共涉及了104个色谱分析的相关知识点,由于文章内容较长,故分为上、下两期分享,文章内容都是干货适合收藏反复查阅。


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  色谱法总论


  1.色谱分析法:色谱法是一种分离分析方法,它利用样品中各组分与流动相和固定相的作用力不同(吸附、分配、交换等性能上的差异),先将它们分离,后按一定顺序检测各组分及其含量的方法。

  2.色谱法的分离原理:当混合物随流动相流经色谱柱时,就会与柱中固定相发生作用(溶解、吸附等),由于混合物中各组分物理化学性质和结构上的差异,与固定相发生作用的大小、强弱不同,在同一推动力作用下,各组分在固定相中的滞留时间不同,从而使混合物中各组分按一定顺序从柱中流出。这种利用各组分在两相中性能上的差异,使混合物中各组分分离的技术,称为色谱法。

  3.流动相——色谱分离过程中携带组分向前移动的物质。

  4.固定相——色谱分离过程中不移动的具有吸附活性的固体或是涂渍在载体表面的液体。

  5.色谱法的特点:

  (1)分离效率高,复杂混合物,有机同系物、异构体。

  (2)灵敏度高,可以检测出μg·g-1(10-6)级甚至ng·g-1(10-9)级的物质量。

  (3)分析速度快,一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。

  (4)应用范围广,气相色谱:沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。液相色谱:高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。

  (5)高选择性:对性质极为相似的组分有很强的分离能力。

  不足之处:被分离组分的定性较为困难。

  6.色谱分析法的分类:按两相状态分类,按操作形式分类,按分离原理分类。

  7.按两相状态分类:气相色谱(GasChromatography,GC);液相色谱(Liquid Chromatography,LC);超临界流体色谱(Supercritical Fluid Chromatography,SFC)。

  气相色谱:

  流动相为气体(称为载气),常用的气相色谱流动相有N2、H2、He等气体;按分离柱不同可分为:填充柱色谱和毛细管柱色谱;按固定相的不同又分为:气固色谱和气液色谱;

  液相色谱:流动相为液体(也称为淋洗液);按固定相的不同分为:液固色谱和液液色谱;

  超临界流体色谱:流动相为超临界流体,超临界流体是一种介于气体和液体之间的状态。超临界流体色谱法是集气相色谱法和液相色谱法的优势而发展起来的一种新型的色谱分离分析技术,不仅能够分析气相色谱不宜分析的高沸点、低挥发性的试样组分,而且具有比高效液相色谱更快的分析速率和更高的柱效率。

  8.按操作形式分类:柱色谱(Column Chromatography,CC):固定相装在柱管内,包括:填充柱色谱和毛细管柱色谱。纸色谱(Paper Chromatography, PC)固定相为滤纸;采用适当溶剂使样品在滤纸上展开而进行分离,薄层色谱(Thin Layer Chromatography, TLC)固定相压成或涂成薄层,操作方法同纸色谱。

  9.按分离原理分类:吸附色谱(Absorption chromatography);分配色谱(Partition Chromatography);离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography);凝胶色谱(Gel Chromatography)。

  10.色谱图:组分在检测器上产生的信号强度对时间(t)所作的图,由于它记录了各组分流出色谱柱的情况,所以,又叫色谱流出曲线,流出曲线的突起部分称为色谱峰。

  11.色谱保留值:色谱保留值是色谱定性分析的依据,它体现了各待测组分在色谱柱上的滞留情况。在固定相中溶解性能越好,或与固定相的吸附性能越强的组分,在柱中的滞留时间越长,或者说,将组分带出色谱柱所需的流动相体积越大,所以,保留值可以用保留时间和保留体积两套参数来描述。

  12.色谱图上的色谱流出曲线可以说明什么问题:根据色谱峰的数目,可判断样品中所含组分的最少个数;根据色谱峰的保留值进行定性分析;根据色谱峰的面积或峰高进行定量分析;根据色谱峰的保留值和区域宽度评价色谱柱的分离效能;根据两峰间的距离,可评价固定相及流动相选择是否合适。

  13.分配比:分配比是指,在一定温度下,组分在两相间分配达到平衡时的质量比。

  14.在色谱流出曲线上,两峰之间的距离主要由两组分在两相间的分配系数还是扩散速度决定?为什么?答:分配系数。两峰间的距离由热力学因素决定,两组分在两相中分配系数差异越大,两峰间的距离则相差越大,越容易被分离。而扩散速度是动力学因素,反映在色谱流出曲线上即为色谱峰的区域宽度(形状)。

  15.色谱理论需要解决的问题:色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径,柱效与分离度的评价指标及其关系。

  16.组分保留时间为何不同?色谱峰为何变宽?组分保留时间:色谱过程的热力学因素控制,(组分和固定液的结构和性质)。色谱峰变宽:色谱过程的动力学因素控制,(两相中的运动阻力,扩散作用)。塔板理论和速率理论分别从热力学和动力学的角度阐述了色谱分离效能及其影响因素。

  17.半经验理论:将色谱分离过程比拟作蒸馏过程,将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复(类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程)。

  18.塔板理论的特点:塔板理论引入了塔板数和塔板高度作为柱效的衡量指标;不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同,用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时,应指明测定物质;柱效不能表示被分离组分的实际分离效果,当两组分的分配系数K相同时,无论该色谱柱的塔板数多大,都无法分离。

  19.塔板理论的不足:塔板理论的基本假设不符合色谱柱的实际分离过程。塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的流动相流速下柱效不同的实验结果,不能说明色谱峰为什么会展宽,同时未能指出影响柱效的因素及提高柱效的途径和方法。

  20.速率方程(也称范第姆特方程式):H=A+B/u+C·u,

  H:塔板高度;

  u:流动相的平均线速度(cm/s)。

  A.─涡流扩散项:A与流动相性质、流动相速率无关。要减小A值,需要从提高固定相的颗粒细度和均匀性以及填充均匀性来解决。对于空心毛细管柱,A=0。固定相颗粒越小dp↓,填充的越均匀,A↓,H↓,柱效n↑,表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻,色谱峰较窄。

  B/u—分子扩散项:存在着浓度差,产生纵向扩散;扩散导致色谱峰变宽,H↑(n↓),分离变差;分子扩散项与流速有关,流速↓,滞留时间↑,扩散↑;

  扩散系数:Dg∝(M载气)-1/2;M载气↑,B值↓。

  C·u—传质阻力项:dp↓,df↓,D ↑ ,可降低传质阻力。

  21.H-u曲线与最佳流速:由于,流速对这两项完全相反的作用,流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值,即,速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。以塔板高度H对应流速u作图,曲线最低点的流速即为最佳流速。

  22.速率理论的要点:组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展、柱效下降的主要原因;通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效;速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响;各种因素相互制约,如,载气流速增大,分子扩散项的影响减小,使柱效提高,但同时传质阻力项的影响增大,又使柱效下降;柱温升高,有利于传质,但又加剧了分子扩散的影响。选择最佳条件,才能使柱效达到最高。

  23.色谱定性方法:

  ①与标样对照的方法:利用保留值定性:通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰,来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。利用加入法定性:将纯物质加入到试样中,观察各组分色谱峰的相对变化。

  ②利用文献保留值定性:利用相对保留值r21定性。相对保留值r21仅与柱温和固定相性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定相上的保留数据,可以用来进行定性鉴定。

  24.色谱定量分析:

  ①定量校正因子:试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比,即,mi=fi’·Ai;绝对校正因子:比例系数fi;单位面积对应的物质量:fI ’=mi/Ai,相对校正因子fi:即,组分的绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比。

  ②常用的几种定量方法:

  (1)归一化法:特点及要求:简便、准确;进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大;仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。

  (2)外标法——标准曲线法:特点及要求:外标法不使用校正因子,准确性较高,操作条件变化对结果准确性影响较大。对进样量的准确性控制要求较高,适用于大批量试样的快速分析。

  (3)内标法:内标物要满足以下要求:(a)试样中不含有该物质;(b)与被测组分性质比较接近;(c)不与试样发生化学反应;(d)出峰位置应位于被测组分附近,且能分离开;(e)加入量适中并与待测组分接近。内标法特点:内标法的准确性较高,操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大;每个试样的分析,都要进行两次称量,不适合大批量试样的快速分析;若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定,则:wi=Ai/As*常数。


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  气相色谱法


  1.气相色谱法(GC):是以气体为流动相的色谱分析法。

  2.气相色谱要求样品:气化,不适用于大部分沸点高和热不稳定的化合物,对于腐蚀性能和反应性能较强的物质更难于分析。大约有15%~20%的有机物能用气相色谱法进行分析。

  3.气相色谱仪的组成:气路系统、进样系统、分离系统、检测系统、温控系统、记录系统。

  4.气路系统:包括气源、净化器和载气流速控制;常用的载气有:氢气、氮气、氦气。

  5.进样系统:包括:进样装置和气化室,气体进样器(六通阀):试样首先充满定量管,切入后,载气携带定量管中的试样气体进入分离柱;液体进样器:不同规格的微量注射器,填充柱色谱常用10μL;毛细管色谱常用1μL;新型仪器带有全自动液体进样器,清洗、润冲、取样、进样、换样等过程自动完成,一次可放置数十个试样。

  6.进样方式:分流进样:样品在汽化室内气化,蒸气大部分经分流管道放空,只有极小一部分被载气导入色谱柱;不分流进样:样品直接注入色谱的汽化室,经过挥发后全部引入色谱柱。

  7.分离系统:色谱柱:填充柱(2~6mm直径,1~5m长),毛细管柱(0.1~0.5mm直径,几十米长)。

  8.温控系统的作用:温度是色谱分离条件的重要选择参数;气化室、色谱柱恒温箱、检测器三部分在色谱仪操作时均需控制温度;气化室:保证液体试样瞬间气化;检测器:保证被分离后的组分通过时不在此冷凝;色谱柱恒温箱:准确控制分离需要的温度。

  9.检测系统:作用:将色谱分离后的各组分的量转变成可测量的电信号;指标:灵敏度、线性范围、响应速度、结构、通用性,通用型——对所有物质均有响应;专属型——对特定物质有高灵敏响应;检测器类型:浓度型检测器:热导检测器、电子捕获检测器;质量型检测器:氢火焰离子化检测器、火焰光度检测器。

  10.热导检测器的主要特点:结构简单,稳定性好;对无机物和有机物都有响应,不破坏样品;灵敏度不高。

  11.氢火焰离子化检测器的特点:优点:(1)典型的质量型检测器;(2)通用型检测器(测含C有机物);(3)氢焰检测器具有结构简单、稳定性好、灵敏度高、响应迅速、死体积小、线性范围宽等特点;(4)比热导检测器的灵敏度高出近3个数量级,检测下限可达10-12g·g-1;缺点:(1)对载气要求高;(2)检测时要破坏样品,无法回收样品;(3)不能检测永久性气体、水及四氯化碳等。。。

  12.电子俘获检测器的特点:对卤素、硫、磷、氮、氧有很强的响应;灵敏度高,可用于痕量农药残留物的分析;线性范围较窄。

  13.火焰光度检测器(FPD):是一种对含硫、磷化合物具有高选择性的检测器。含硫、磷化合物在富氢火焰中燃烧被打成有机碎片,发出不同波长的特征光谱。

  14.固定相:固体固定相:固体吸附剂;液体固定相:由载体和固定液组成;聚合物固定相。

  15.固体固定相:一般为固体吸附剂,常用的有活性炭,硅胶,氧化铝和分子筛。优点:吸附容量大、热稳定性好、价格便宜;缺点:柱效低、吸附活性中心易中毒,使用前要进行活化。应用:主要用于惰性气体、H2、O2、N2、CO、CO2和CH4等一般气体和低沸点物质。

  16.作为载体使用的物质应满足的条件:表面有微孔结构,孔径均匀,比表面积大;化学和物理惰性,即,与样品组分不起化学反应,无吸附作用或吸附很弱;热稳定性好;有一定的机械强度和浸润性,不易破碎;具有一定的粒度和规则的形状,最好是球形。

  17.对固定液的要求:在使用温度下是液体,具有较低的挥发性;具有良好的热稳定性;对要分离的各组分应具有合适的分配系数;化学稳定性好,不与样品组分、载气、载体发生任何化学反应。

  18.固定液的分类:非极性固定液、中等极性固定液、强极性固定液、氢键型固定液。

  19.非极性固定液:主要是一些饱和烷烃和甲基硅油,它们与待测物质分子之间的作用力以色散力为主。组分按沸点由低到高顺序流出,若样品中兼有极性和非极性组分,则同沸点的极性组分先出峰。常用的固定液有角鲨烷(异三十烷)、阿皮松等。。。适用于非极性和弱极性化合物的分析。

  20.中等极性固定液:由较大的烷基和少量的极性基团或可以诱导极化的基团组成,它们与待测物质分子间的作用力以色散力和诱导力为主,组分基本上按沸点顺序出峰,同沸点的非极性组分先出峰。常用的固定液有邻苯二甲酸二壬酯、聚酯等,适用于弱极性和中等极性化合物的分析。

  21.强极性固定液:含有较强的极性基团,它们与待测物质分子间作用力以静电力和诱导力为主,组分按极性由小到大的顺序出峰。常用的固定液有氧二丙腈等,适用于极性化合物的分析。

  22.氢键型固定液:是强极性固定液中特殊的一类,与待测物质分子间作用力以氢键力为主,组分依形成氢键的难易程度出峰,不易形成氢键的组分先出峰。常用的固定液有聚乙二醇、三乙醇胺等,适用于分析含F、N、O等的化合物。

  23.固定液的选择:①按极性相似原则选择:极性相似,溶解度大,分配系数大,保留时间长;②按官能团相似选择:酯类——酯或聚酯类固定液;醇类——聚乙二醇固定液。③按主要差别选择:各组分间沸点是主要差别——非极性固定液;极性为主要差别——极性固定液。④选择混合固定液:对于难分离的复杂样品,可选用两种或两种以上固定液。

  24.聚合物固定相:既可作为固体固定相,也可作为载体,又称高分子多孔微球。物质在其表面既存在吸附作用,又存在溶解作用。(1)具有较大的比表面积,表面孔径均匀;(2)对非极性及极性物质无有害的吸附活性,拖尾现象小,极性组分也能出对称峰;(3)由于不存在液膜,无流失现象,热稳定性好;(4)机械强度和耐腐蚀性较好,系均匀球形,在填充柱色谱中均匀性、重现性好,有助于减少涡流扩散。

  25.载气种类的选择:检测器的适应性,载气流速的大小。

  26.柱温的选择:(1)首先应使柱温控制在固定液的最高使用温度(超过该温度固定液易流失)和最低使用温度(低于此温度固定液以固体形式存在)范围之内。(2)提高柱温,可以改善传质阻力,有利于提高柱效,缩短分析时间,但降低了容量因子和选择性,不利于分离。一般的原则是:在使最难分离的组分尽可能分离的前提下,尽量采用较低的柱温,但以保留时间适宜,峰形不拖尾为度。(3)柱温一般选择在接近或略低于组分平均沸点时的温度。(4)组分复杂,沸程宽的试样,采用程序升温。

  27.载体和固定液含量的选择:配比:固定液在载体上的涂渍量,一般指的是固定液与担体的百分比,填充柱的配比通常在5%~25%之间。配比越低,担体上形成的液膜越薄,传质阻力越小,柱效越高,分析速度也越快。配比较低时,固定相的负载量低,允许的进样量较小。分析工作中通常倾向于使用较低的配比。

  28.进样条件的选择:进样量应控制在柱容量允许范围及检测器线性检测范围之内,进样要求动作快、时间短,汽化室一般较柱温高30~70°C。

  29.提高色谱分离能力的途径:(1)塔板理论:增加柱长,减小柱径,即增加柱子塔板数;(2)速率理论:减小组分在柱中的涡流扩散和传质阻力,可降低塔板高度。

  30.毛细管色谱柱的结构特点:(1) 不装填料阻力小,长度可达百米的毛细管柱,管径0.2mm;(2)气流单途径通过柱子,消除了组分在柱中的涡流扩散;(3)固定液直接涂在管壁上,总柱内壁面积较大,涂层很薄,则气相和液相传质阻力大大降低。(4)毛细管色谱柱柱效高达每米3000~4000块理论塔板,一支长度100米的毛细管柱,总的理论塔板数可达104~106。

  31.毛细管色谱具有以下优点:(1)分离效率高:比填充柱高10~100倍;(2)分析速度快:用毛细管色谱分析比用填充柱色谱速度;(3)色谱峰窄、峰形对称,较多采用程序升温方式;(4)灵敏度高,一般采用氢焰检测器。(5)涡流扩散为零。

  32.毛细管色谱的类型:(1)涂壁毛细管柱:将固定液直接涂敷在管内壁上。柱制作相对简单,但柱制备的重现性差、寿命短。(2)多孔层毛细管柱:在管壁上涂敷一层多孔性吸附剂固体微粒,构成毛细管气固色谱。(3)载体涂渍毛细管柱:将非常细的担体微粒粘接在管壁上,再涂固定液。柱效较涂壁毛细管柱高。(4)化学键合或交联毛细管柱:将固定液通过化学反应键合在管壁上或交联在一起。使柱效和柱寿命进一步提高。

  --未完,下期分享液相色谱及质谱知识点--


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