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【分析必读】药物分析逃不过的色谱知识——液相、质谱48个核心知识点(下)
发表于:2019-09-16 浏览:759

  本篇文章接上期分享《【分析必读】药物分析逃不过的色谱知识——色谱总论、气相色谱56个核心知识点(上)》。

  上下两篇文章共分为了四个部分:色谱法总论、气相色谱法、高效液相色谱法、质谱分析法,共涉及了104个色谱分析的相关知识点,内容都是干货适合收藏反复查阅。


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  高效液相色谱法


  1.与气相色谱相比液相色谱的优点与气相色谱法相比,液相色谱法不受样品挥发性和热稳定性及相对分子质量的限制,只要求把样品制成溶液即可,非常适合于分离生物大分子、离子型化合物,不稳定的天然产物以及其他各种高分子化合物等。此外,液相色谱的流动相不仅起到使样品沿色谱柱移动的作用,而且与固定相一样,与样品分子发生选择性的相互作用,这就为控制和改善分离条件提供了一个额外的可变因素。而气相色谱法采用的流动相是惰性气体,对组分没有亲和力,仅起运载作用。

  2.液相色谱特点:高压、高速、高效、高灵敏度、高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。

  3.高效液相相色谱仪的组成:高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、数据处理系统。

  4.流动相使用前必须脱气:常用的脱气方法有:低压脱气法(电磁搅拌、水泵抽空,可同时加热或向溶剂吹氮气)、吹氦气脱气法和超声波脱气法等。

  5.梯度洗脱:用两种(或多种)不同极性的溶剂,在分离过程中按一定程序连续改变流动相中溶剂的配比和极性,通过流动相中极性的变化来改变被分离组分的分离因素,以提高分离效果。

  6.高压梯度(内梯度):特点是先加压后混合,将溶剂用高压泵增压以后输入色谱系统的梯度混合室,加以混合后送入色谱柱。低压梯度(外梯度):特点是先混合后加压。在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱。

  7.进样系统要求:良好的密封性,最小的死体积,最好的稳定性,进样时对色谱系统压力、流量影响较小。

  8.分离系统:色谱柱是实现分离的核心部件。由柱管和固定相组成。柱管为直型不锈钢管。一般色谱柱长5~30cm,内径4~5mm,凝胶色谱柱内径3~12mm,而制备色谱柱内径则可达25mm。一般淋洗溶剂在进入色谱分离柱之前,先通过前置柱。HPLC柱的填料颗粒粒径一般约为3~10m,填充常采用匀浆法,色谱柱的发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。

  9.检测系统:作用——用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。紫外-可见吸收检测器、光电二极管阵列检测器、示差折光检测器、荧光检测器、电化学检测器。

  10.高效液相色谱法对流动相的要求:流动相不与色谱柱发生不可逆化学变化,以保持柱效或柱子的保留性质较长时间不变;对待测样品有足够的溶解能力;与所用检测器相匹配;粘度尽可能小,以获得较高的柱效;流动相纯度要高,价格便宜,毒性小。

  11.高效液相色谱法的固定相的分类:(1)按固定相承受压力分:刚性固体:以二氧化硅为基质,可承受较高压力,表面可键合各种功能官能团——键合固定相,是目前应用最广泛的固定相。硬胶:主要用于离子交换色谱法和凝胶色谱法中,由聚苯乙烯与二乙烯基苯交联而成,可承受的压力较低。(2)按孔隙深度分:表面多孔型:基体是球形玻璃珠,在玻璃表面涂覆一层多孔活性物质如硅胶、氧化铝、聚酰胺、离子交换树脂、分子筛等。优点:适用于快速分离、填充均匀紧密、机械强度高、能承受高压,适于简单的样品及常规分析;缺点:多孔层薄,进样量受限制;全多孔型:由硅胶颗粒聚集而成,比表面积大,柱容量大,小颗粒全孔型固定相孔洞浅传质速率快,柱效高,分离效果好,适合于复杂样品、痕量组分的分离分析,是目前HPLC中应用最广泛的固定相。

  12.液固吸附色谱法原理:是以固体吸附剂为固定相,吸附剂表面的活性中心具有吸附能力,试样分子被流动相带入柱内时,它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附。分离过程是一个吸附-解吸的平衡过程。13.液固吸附色谱法固定相:通常是硅胶、氧化铝、活性炭等固体吸附剂,硅胶最常用;流动相:极性大的试样需用极性强的洗脱剂,极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。应用:几何异构体分离和族分离,如农药异构体;石油中烷、烯、芳烃的分离。不适于强极性的离子型样品的分离,不适于分离同系物(因为,它对相对分子质量的选择性较小)。

  14.液液分配色谱法原理:根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同实现分离,分配系数较大的组分保留值也较大。

  15.液液分配色谱法流动相:流动相与固定液应尽量不互溶,或者二者的极性相差越大越好。根据流动相与固定相极性的差别程度,可将液液色谱分为正相分配色谱(流动相极性小于固定相极性,极性小的先流出,适于强极性和中等极性组分分离)和反相分配色谱(流动相极性大于固定相极性,极性大的先流出,适于非极性或弱极性组分分离)。固定相:由载体和固定液组成。常用的固定液有b,b’-氧二丙腈、聚乙二醇、聚酰胺、正十八烷、角鲨烷等。应用:同系物组分的分离。例:分离水解蛋白质所生成的各种氨基酸,分离脂肪酸同系物等。

  16.化学键合固定相:化学键合固定相是利用化学反应将有机分子键合到载体表面上,形成均一、牢固的单分子薄层而构成各种性能的固定相。

  17.化学键合固定相的特点:固定相不易流失,柱的稳定性和寿命较高;能耐受各种溶剂,可用于梯度洗脱;表面较为均一。没有液坑,传质快,柱效高;能键合不同基团以改变其选择性。例如,键合氰基、氨基等极性集团用于正相色谱法,键合离子交换基团用于离子色谱法,键合C2、C4、C6、C8、C18、C16、C18、C22烷基和苯基等非极性基团用于反相色谱法等。因此,它是HPLC较为理想的固定相。

  18.离子交换色谱法原理:离子交换色谱法的固定相是离子交换树脂,流动相是水溶液,它是利用待测样品中各组分离子与离子交换树脂的亲和力的不同而进行分离的。

  19.离子交换色谱法流动相:水的缓冲溶液,阴离子离子交换树脂作固定相,采用酸性水溶液;阳离子离子交换树脂作固定相,采用碱性水溶液;应用:离子及可离解的化合物,氨基酸、核酸等。

  20.凝胶色谱法原理:凝胶色谱法的固定相为多孔性凝胶类物质,流动相为水溶液或有机溶剂,它是根据不同组分分子体积的大小进行分离的。小分子可以扩散到凝胶空隙,由其中通过,出峰最慢;中等分子只能通过部分凝胶空隙,中速通过;而大分子被排斥在外,出峰最快;溶剂分子小,故在最后出峰。全部在死体积前出峰;可对相对分子质量在100~105范围内的化合物按质量分离。

  21.凝胶色谱法流动相:能溶解样品且与凝胶相似(润湿凝胶并防止吸附作用)、粘度小(增加扩散速度)。常用四氢呋喃、苯、氯仿、水等。

  22.影响分离的因素与提高柱效的途径:(1)液体的黏度比气体大一百倍,密度为气体的一千倍左右,故降低传质阻力是提高柱效主要途径。(2)由速率方程,降低固定相粒度可提高柱效。(3)液相色谱中,不可能通过增加柱温来改善传质。(4)恒温改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。(5)流速大于0.5cm/s时, H~u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速,柱效提高不是很大。但在实际操作中,流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。(6)气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱,其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中,分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作,一般很少自行制备。


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  质谱分析法


  1.质谱法定义:是将待测物质置于离子源中电离形成带电离子,让离子加速并通过磁场或电场后,离子将按质荷比(m/z)大小分离,形成质谱图。依据质谱线的位置和质谱线的相对强度建立的分析方法称为质谱法。

  2.质谱的作用:准确测定物质的分子量;质谱法是唯一可以确定分子式的方法;根据碎片特征进行化合物的结构分析。

  3.质谱分析的基本原理:质谱法是利用电磁学原理,将待测样品分子解离成具有不同质量的离子,然后按其质荷比(m/z)的大小依次排列收集成质谱。根据质谱中的分子离子峰(M+)可以获得样品分子的相对分子质量信息;根据各离子峰(分子离子峰、同位素离子峰、碎片离子峰、亚稳离子峰、重排离子峰等)及其相对强度和氮数规则,可以确定化合物的分子式;根据各离子峰及物质化学键的断裂规律可以进行定性分析和结构分析;根据组分质谱峰的峰高与浓度间的线性关系可以进行定量分析。

  4.质谱分析的过程:(1)进样,化合物通过汽化引入电离室;(2)离子化,在电离室,组分分子被一束加速电子碰撞,撞击使分子电离形成正离子;(3)离子也可因撞击强烈而形成碎片离子;(4)荷正电离子被加速电压V加速,产生一定的速度v,与质量、电荷及加速电压有关;(5)加速正离子进入一个强度为B的磁场(质量分析器),发生偏转。

  5.质谱仪的组成:真空系统、进样系统、离子源或电离室、质量分析器、离子检测器。

  6.真空系统作用:是减少离子碰撞损失,若真空度低:大量氧会烧坏离子源的灯丝;会使本底增高,干扰质谱图;引起额外的离子-分子反应,改变裂解模型,使质谱解释复杂化;干扰离子源中电子束的正常调节;用作加速离子的几千伏高压会引起放电等。

  7.进样系统目的:高效重复地将样品引入到离子源中并且不能造成真空度的降低;间歇式进样系统——气体及低沸点、易挥发的液体;直接探针进样——高沸点的液体、固体;色谱进样系统——有机化合物。

  8.离子源或电离室:作用是使试样中的原子、分子电离成离子,其性能影响质谱仪的灵敏度和分辨率本领。电子电离源的特点:电离电压:70eV;加一小磁场增加电离几率;EI源电离效率高,碎片离子多,结构信息丰富,有标准化合物质谱库;结构简单,操作方便;样品在气态下电离,不能汽化的样品不能分析,主要用于气-质联用仪;有些样品得不到分子离子。

  9.化学电离源特点:电离能小,质谱峰数少,谱图简单;最强峰为(M+1)+准分子离子峰;不适用难挥发试样。

  10.快原子轰击源:高能量的Xe原子轰击涂在靶上的样品,溅射出离子流。本法适合于高极性、大分子量、低蒸汽压、热稳定性差的样品,FAB一般用作磁式质谱的离子源。

  11.电喷雾源结构:喷嘴(金属毛细管),雾化气,干燥气。原理:喷雾蒸发电压。特点:ESI是最软的一种电离方式,只产生分子离子,不产生碎片离子;适用于强极性,大分子量的样品分析,如,肽,蛋白质,糖等;产生的离子带有多电荷,尤其是生物大分子;主要用于液相色谱-质谱联用仪,既用作液相色谱和质谱仪之间的接口装置,同时又是电离装置。

  12.场致电离源(FI)和场解吸电离源(FD):分子离子峰强;碎片离子峰少;不适合化合物结构鉴定。

  13.基质辅助激光解吸电离特点:准分子离子峰很强且碎片离子少。通常用于飞行时间质谱,特别适合测定多肽、蛋白质、DNA片段、多糖等的相对分子质量。

  14.质量分析器作用:将离子源产生的离子按质荷比m/z的大小分开。

  15.单聚焦分析器:离子的m/z与R,B,V有关。通过改变磁场可以把不同离子分开。在一定磁感应强度B下,改变加速电压V可以使不同离子先后通过检测器,实现质量扫描,得到质谱。特点:结构简单,操作方便;只有方向聚焦,无能量聚焦,分辨率低。

  16.双聚焦分析器:实现方向聚焦和能量(速度)聚焦;对于动能不同的离子,通过调节电场能,达到聚焦的目的。特点:分辨率高。

  17.四级杆质量分析器:特点:结构简单,体积小、重量轻,扫描速率快,适合与色谱联机。

  18.飞行时间质量分析器:特点:质量范围宽,扫描速率快,既不需磁场也不需电场,只需要直线漂移空间。

  19.离子阱质量分析器:特定m/z离子在阱内一定轨道上稳定旋转,改变端电极电压,不同m/z离子飞出阱到达检测器。特点:结构简单、易于操作、灵敏度高。

  20.质谱的表示方法:质谱一般可用线谱或表谱两种方法表示,常用线谱;线谱上的各条直线表示一个离子峰,横坐标为质荷比m/z,纵坐标为离子的相对强度(相对丰度),一般将原始质谱图上最强的离子峰定为基峰并定为相对强度100%,其他离子峰以对基峰的相对百分值表示。能够很直观地观察到整个分子的质谱全貌;质谱表是用表格形式表示的质谱数据,质谱表中有两项即质荷比及相对强度,对定量计算较直观。

  21.质谱仪的分辨率:分辨率(R)指质谱仪能区别邻近两个质谱峰的能力,对两个相等强度的相邻峰,当两峰间的峰谷不大于其峰高10%时,则认为两峰已经分开。

  22.质谱图中主要离子峰的类型:分子离子峰、同位素离子峰、碎片离子峰、亚稳离子峰、重排离子峰。

  23.相对分子质量的测定:分子离子峰的m/z相当于该化合物的相对分子质量。一般除同位素离子峰外,分子离子峰是质谱图中最大质荷比的峰,位于质谱图的最右端。

  24.确认分子离子峰的方法:(1)分子离子峰必须符合氮数规则:有机化合物含有偶数个氮原子或不含氮原子,分子离子峰的m/z一定是偶数;含奇数个氮原子,分子离子峰的m/z一定是奇数;

  (2)分子离子峰与相邻离子峰的质量差应合理,如,不可能出现比分子离子峰质量小4~13个质量单位的峰;

  (3)当化合物中含S,Br,Cl时,可利用M+(M2+)+等同位素离子峰的比例来确认分子离子峰。

  (4)改变质谱仪的操作条件,提高分子离子峰的相对强度。

  ※采用化学电离源或降低电子轰击源电压可获得较强的M+峰。

  25.气相色谱-质谱联用仪:

  质谱:纯物质结构分析。

  色谱:化合物分离,定性能力差。

  色谱-质谱联用:共同优点,GC-MS、LC-MS、CE-MS,色谱是质谱的进样及分离系统,质谱是色谱的检测器。

  主要问题:接口技术,除去色谱中大量的流动相分子。

  适用范围:适用于挥发度低、难气化、极性强、相对分子质量大及热稳定性差的样品。

  26.无损检测定义:

  无损检测技术即非破坏性检测,就是在不破坏待测物质原来的状态、化学性质等前提下,为获取与待测物的品质有关的内容、性质或成分等物理、化学情报所采用的检查方法。

  ------------THE END------------


  内容来源:网络

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