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【药物分析】深度剖析等度洗脱和梯度洗脱的适用范围和方法设置
发表于:2019-04-16 浏览:824

   授权转载自色谱学堂


  做液相色谱的同学都知道,液相色谱分离条件中,最重要的参数就是洗脱条件,其中分离条件又分为等度洗脱梯度洗脱


  等度洗脱

  是指在样品组分的分析周期中,流动相的组成比例和流速恒定不变的洗脱方式。


  梯度洗脱

  是指在同一个分析周期中,按一定程度不断改变流动相的浓度配比的洗脱方式。

  在色谱分析时,等度洗脱和梯度洗脱各有优势和劣势。


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  等度洗脱


  优点

  对于等度洗脱而言,由于方法运行时,流动相的比例不发生变化,所以它对仪器的要求不高,只需要一个单元泵就可以运行方法。


  其次,由于等度洗脱条件单一,所以比较容易用来摸索方法设置,例如改变流动相比例,改变柱温等条件。


  并且由于等度洗脱每次运行时的流动相比例相同,所以相同方法运行多个样品时,样品之间不需要设置平衡时间来让系统恢复到所需的流动相比例。


  缺点

  但是它也有缺点,那就是越往后出峰的组分色谱峰越宽。


  并且大多数等度洗脱的方法分析时间较长。


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     梯度洗脱


  优点

  而梯度洗脱能够规避掉等度洗脱的问题,例如梯度洗脱的样品峰,无论先出峰还是后出峰的组分,它们的峰形基本都能保证尖锐对称


  其次由于梯度洗脱通常设置的流动相比例是让洗脱强度越来越强,这样能保证在较短的时间内,让样品中强保留组分也能被洗脱出来。


  缺点

  但是伴随着这些优点也会有对应的缺点,首先它对仪器的配置要求较高,通常需要配置四元泵或者二元泵。


  其次它在每次运行样品之间,需要设置一定的平衡时间,来让系统中流动相的比例到达初始流动相比例。


  最后,由于它的方法设置复杂,例如影响分离的有初始流动相比例、流动相的梯度变化、结束流动相比例、柱温箱温度等,所以方法的开发和优化会较为复杂。


  了解了这么多等度洗脱和梯度洗脱的优缺点,很多同学可能会有疑问,我如何知道我的样品适合等度洗脱还是梯度洗脱呢?


  不用着急,这是有规律可循的。


  对于常规样品而言,建议大家在初始设置方法时可以先参考以下初始条件运行:20分钟内,将有机相比例从5-10%线性升高至100%,并保持一段时间以保证所有组分被洗脱出来。


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  如果在梯度结束后,有组分的洗脱时间超过梯度时间的25%,也就是该条件中如果有化合物在25分钟之后被洗脱出来,则需要考虑更换保留能力更弱的色谱柱或更换极性更强的有机溶剂。


  我们可以通过以下公式来计算:


20190416111073.jpg


  我们可以看出 ΔtG>0.25 tG,所以该方法不适合等度洗脱。

  适合等度洗脱的方法要求 ΔtG<0.25tG。

  等度洗脱如何设置


  如果你的方法适合等度洗脱,那么又该如何设置呢?


  我们还以上面的这个样品为例,可以参考如下计算:


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  tr(avg)=(ti+tf)/2=17min


  Δ%B/min=(%Bfinal-%Binitial)/tG=(100-5)/20=4.75 %B/min


  等度洗脱流动相比例=(Δ%B/min x tr(avg))+%Binitial=(4.75x17)+ 5=85.75≈86%B


  综上所述,如果该样品可以用等度洗脱,那么方法设置为:水相与有机相比例为14:86,保持17min。


  同学们在做方法设置时可以参考以上条件设置,如果做出来的图形不能完全满意,在此基础上微调即可。

  梯度洗脱如何设置


  如果该样品需要做梯度洗脱,方法参数又该如何设置呢?


  梯度洗脱主要包括以下几个参数:初始流动相比例、结束流动相比例和流动相变化速率,同样以之前的样品为例:


  Δ%B/min=(%Bfinal-%Binitial)/tG=(100-5)/20=4.75 %B/min


  调整后的初始流动相比例

  Optimized%Binitial

  =(%Binitial+(tixΔ%B/min))-(V/FxΔ%B/min)-10%B

  =(5+(12.786x4.75))-(5.5/2x4.75)-10

  =42.67%B


  调整后的结束流动相比例

  Optimized%Bfinal

  =(%Binitial+(tfxΔ%B/min))-(V/FxΔ%B/min)-10%B

  =(5+(21.142x4.75))-(5.5/2x4.75)-10

  =82.36%B


  通过计算得到调整后的初始流动相比例等于42.67%,调整后的结束流动相比例等于82.36%。


  如果按照以上计算出来的条件,流动相从42%到83%,运行时间20min,得到的样品图如下所示:


20190416725515.jpg


  在方法开发时,同学们可以在以上基础谱图下再次进行调整,直到达到满意的分离度和分析时间。


  关于等度洗脱和梯度洗脱的方法设置,今天就讲到这里,谢谢观看。


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