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【药物分析】带新宝典,药研10年总结的样品前处理中滤膜选择方法
发表于:2019-05-21 浏览:515

  最近小编遇到一个事情很是恼火,刚刚购买的色谱柱,进样不到20针,主峰竟然分叉,不管如何洗脱都无法恢复。

  浪费资金不说吧,还严重影响实验进度。

  咨询工程师归结原因为样品太脏,造成筛板塌陷。

  难道滤膜选择有问题?

  心塞啊!孰是孰非已说不清楚。

  唯有继续严谨把控样品前处理,保护色谱柱和液相进样系统。


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  对于分析工作来说,样品前处理是必不可少的环节,同时也是一项技术性工作。

  不管超声,还是振荡,保证主药溶解以后,都要进行过滤再进入液相系统。

  其中滤膜的作用至关重要。今天小编就来818滤膜的事情。

  为什么要拿这么简单的滤膜选择的事情出来讲,有一个至关重要的原因,哪个新手没有因为滤膜毁掉一次实验。。。

  1.有机试剂一不小心用了水系膜。结果差点把某些杂峰给当成未知杂质。。。

  2.做溶出,滤膜孔径不合适,结果取出来的样滤不过去。。手忙脚乱重新找膜差点耽误一整锅溶出。。。

  3.不做滤膜吸附试验,差点以为原研的溶出不合格。。。

  所以,在试验开始之前大家都先把这篇文发给自己带的新手看一下!


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  滤膜最重要的功能是啥?


  答:分析系统的大门,保护作用!

  微孔滤膜是利用高分子化学材料,致孔添加剂经特殊处理后涂抹在支撑层上制作而成。主要用于色谱分析中流动相及样品的过滤,对保护色谱柱及输液泵管系统和进样阀等不被污染具有良好的作用。


  1.过滤以后的溶剂和样品,会对色谱柱和液相进样系统起到保护作用。

  对色谱柱的影响:

  由于填料颗粒很细,色谱柱内空隙极小,溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和筛板堵塞。

  对液相进样系统的影响:

  溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损,同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。


  2.消除由于污染对分析结果的影响。

  对于常用的紫外检测器和二极管阵列检测器,如果样品浓度比较低,颗粒会造成噪声比较大,基线不稳,感染正常信号,影响检测结果。


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  常用滤膜类型


  常用滤膜分为水系和有机系两种。


  水系膜

  水系滤膜通常为混合纤维素酯滤膜,使用前常需进行水浸处理,防止滤膜使用时未压紧有气泡入内,同时水浸可以使膜充分溶胀。


  有机膜

  有机系滤膜有尼龙滤膜、聚偏氟乙烯滤膜、聚四氟乙烯滤膜等,使用前不需预先湿润,几乎能与全部溶出介质相容。使用过程中,根据所过滤样品选择合适的滤膜。


  聚四氟乙烯膜(PTFE)/聚偏氟乙烯膜(PVDF):

  惰性较强,适用于所有溶剂,酸和盐,并无任何可溶物。


  尼龙滤膜(N6、N66):

  通用型,满足纯水样品和水/有机混合样品。适用于绝大多数有机溶剂和水溶液,可用于强酸,70%乙醇,二氯甲烷,不适用于二甲基甲酰胺。


  再生纤维素膜(RC):

  适用于水溶性样品和有机溶剂。


  聚醚砜滤膜(PES):

  适用于水溶性样品的过滤,不适用于酮类、酯类、油类等极性溶液及高浓度的酸溶液。


  混合纤维素酯膜(WX):

  适用于水溶液,不耐酸、碱、有机溶剂。


  偏氟膜(F膜):

  适用于有机溶剂及空气过滤,可用于有机溶剂除微粒,提高试剂级别等。


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  如何选择滤膜


  对于虑膜选择主要从材质和孔径两方面来来考虑:


  材质的筛选

  有机系滤膜:

  用于有机相或者有机相溶液的过滤,如过滤水溶液错选了有机膜,会导致过滤流速极低或者干脆无法过滤。

  水系滤膜:

  只能过滤水溶液,过滤有机相溶液时,滤膜会溶解掉,溶有滤膜的溶剂会对液相仪器以及色谱柱造成严重损伤。


  水/有机混合流动相的过滤,首选有机相滤膜。

  如果混合流动相中有机相的比例偏少,可先用有机溶剂(甲醇或乙腈)将滤膜润湿以后再进行流动相的过滤。


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  过滤溶剂或者流动相一般用溶剂过滤器+膜过滤。

  过滤样品一般用针式过滤器,膜直径为13mm,可以过滤0.5-2ml的样品,如果样品量更大,可以选择直径为25mm的。


  孔径的选择

  常用滤膜的过滤原理一般为机械截留,即截留比它孔径大或孔径相当的微粒等杂质。因此,滤膜的孔径直接决定了选择性。

  常用滤膜的孔径从0.1μm到10μm不等。

  溶出、紫外、液相等分析检测常用滤膜的孔径通常为0.22μm、0.45μm和0.8μm。


  0.22um:

  去除样品,流动相中极细颗粒,适用于要求较高的溶剂和样品的处理,如色谱用离子对试剂、超纯水、质谱分析溶剂的样品等的过滤。


  0.45um:

  能滤过大多数微生物,适用于常规样品、流动相的过滤,能够满足一般色谱要求。


  0.8um:

  去除大多数不溶性微粒,适用于紫外等对样品要求相对较低的分析检测,尤其适用于难溶性辅料多、混悬剂和粘合剂用量大、且使用紫外检测的口服固体制剂溶出检测。


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  针式过滤器使用窍门


  针式过滤器是大家做溶出、和液相样品前处理最常用的。一天不知道会有多少次,小编今天就讲一些大家平时很少注意的小窍门。

  1.在吸入样品前,先向注射器中吸取约1ml的空气,可以使液体残留量最小;

  2.样品吸入注射器中,倒置注射器并将顶端的残留物擦净,将针式过滤器连接到注射器上,轻轻拧紧保证良好密封;

  3.将注射器内的样品过滤后注入进样瓶中;

  4.取下过滤器,将空气吸入注射器,重新连接过滤头,按下推杆过滤出所有残余样品。最大程度提高样品回收率。

  温馨提示:在过滤过程中,最好不使用小于10ml的注射器,以免压力过高引起液体崩漏。


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  滤膜吸附试验的设计


  滤膜使用前需进行考察,明确是否对待测成分有吸附作用。

  无论溶出度,还是含量、有关物质,如果滤膜有影响会导致后续产出的结果都是错的。

  无论药物结构如何,在试验开始之前考察一下总是对的。

  针对不同的分析检测项目,判断滤膜吸附及验证的方法略有不同。


  溶出度测定

  开始溶出试验前,滤膜吸附试验是必须进行的。

  滤膜吸附试验方法如下:

  (1)取对照品溶液按规定的方法,对比未过滤直接进样和过滤后的吸光度/峰面积值。

  (2)或采用原料加空白辅料的方式配置溶液。分别用高速离心和滤膜过滤的方法处理。对比离心上清液和过滤后溶液的吸光度/峰面积。

  (3)分别弃去不同体积的初滤液的考察,参考下表。


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以上方法仅供参考,实际项目不同操作方法不同,请根据实际情况进行调整。


  ◆ 滤膜吸附试的判定标准

  滤膜吸附应在2%以下

  按下述公式计算回收率或吸附率:

  * 回收率Recovery% = A(过滤) / A(过滤前或离心) ×100%

  * 吸附率= 100%-Recovery%

  其中:A为UV吸光度或HPLC峰面积值。

  若回收率在98%~102%之间,即吸附率不超过2%,滤膜吸附作用可忽略不计。


  ◆ 滤膜吸附过大处理方法如下:

  (1)将滤膜在水中煮沸1h以上后再次尝试;

  (2)更换滤膜材质或者品牌。或者采用进口滤膜。


  不同的滤膜、不同的处方工艺生产的产品,其吸附作用不尽相同,应通过实验得出正确结论。若滤膜对原料药不存在吸附现象,但是样品溶出度偏低,可以考虑是否存在辅料吸附API然后被滤除的现象。


  对于具有明显吸附的品种,应在内控标准中标明所用滤膜的材质、品牌和规格,以及需要弃去初滤液的体积,以确保检测结果准确,可重现。


  ◆ 什么样的样品容易产生滤膜吸附现象

  发生吸附的品种,往往是主药均难溶于水,制成制剂时进行过微粉化等处理。

  这时原料药粒径变小,比表面能变大,静电吸附能力增强,所以与滤膜的吸附作用会比较明显。

  一些小规格制剂溶出液中主药浓度低,达到饱和所需的初滤液体积明显增加,干扰也会变大。


  含量测定、有关物质测定

  含量和有关物质使用的溶剂一般都能使样品中主药完全溶出,因此使用样品溶液考察吸附性即可。


  而对于有关物质检测,如果所用溶剂中有机相比例较高,更需要关注滤膜过滤后是否会产生新的杂质。


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