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【药研分析】99个关于色谱柱的问题解答!你关心的的都在这里了!(五)
发表于:2019-05-27 浏览:688

  86、我在做一个模拟胃内容物中药物反应试验,需要动态测定某药品含量变化。分析时碰到一个棘手问题,进样量同样用20ul,用对照品进样时色谱峰形不错,进样品时却一直不能得到好的峰形。后来分析是模拟胃内容物样品的酸度过高的因素,可我通过稀释的方法让样品酸度和流动相接近,虽然峰形没问题了,却发现因稀释导致分析物在样品中含量下降,低于最低检测限了,如何是好呢?

  答:稀释很方便,但灵敏度更高的检测器不容易找,不过还是有个简单的解决方案。

  当用流动相稀释样品时,只要稀释后样品中有机相含量比流动相中的有机相比例低10个百分点以上(如流动相中甲醇含量是40%,则样品中甲醇含量一定要低于30%),样品流动会被色谱柱进口端延缓或阻挡,称为“柱上富集”。由于“柱上富集”作用的存在,这种情况下进行大体积样品进样,可避免样品溶剂组成和流动相一样时进样量过大产生的“峰展宽”。针对你提的这个实例,可用稀的NaOH溶液调节样品pH和流动相匹配,并将样品最终稀释一倍。将进样量提高一倍到40ul,就可达到最低检测限的要求。


  87、峰形后拖尾是什么原因造成的?

  答:[柱物理损坏]

  色谱柱有物理损坏是造成峰形拖尾的根源。唯一的解决方法就是更换新柱。

  [柱内填料污染]

  流动相和样品中的杂质是色谱柱主要污染源。

  流动相所用的各种溶剂至少是分析纯,尽量使用色谱纯试剂。流动相所用的水最好是超纯水或全玻璃器皿双蒸水。用前先用0.45um溶剂微孔过滤(器)过滤,除去可能存在的微粒。流动相建议现用现配,对于含盐的溶液尤其注意长置会产生细菌或出现沉淀。此外还得保证储存流动相的容器清洁。

  复杂样品可选用0.45um溶剂微孔过滤(器)或样品预处理柱对样品进行预处理,确保样品中不含微粒杂质。若样品不便处理,要使用保护柱。柱内填料污染时,可将柱头螺丝卸下,用专用工具挖出柱内前段被污染填料,再以相同的填料重新填入,修复。或以能溶解污染物的流动相按色谱柱使用的相反方向,冲洗色谱柱(约20至30倍柱体积,或视具体情况而定;另外,此时不能接检测器),将污染物冲出色谱柱,再按色谱柱标明的使用方向使用。

  [柱进口处有异物]

  当断定是柱进口处有异物时,可将柱头螺丝卸下,取出滤帽并将其置于20%硝酸溶液中,用超声波清洗约20分钟,再置于超纯水中,并用超声波清洗约10分钟,重新装入色谱柱内即可。

  [样品浓度过高致使柱超载]

  样品在柱上超载能引起峰展宽,拖尾(或伸舌)。

  适当减小进样量或样品浓度(需要时,可提高检测器灵敏度)直至峰形和保留时间不再改变,便可消除这种不良影响。减小进样量还能改善其分离度。正常情况下,样品中每种化合物在150×4.6mm柱中进样量保持在3~50ug范围内,不会引起明显超载。

  [样品溶剂不对]

  选择合适的样品溶剂,以排除不必要的干扰。最好选用流动相溶解样品。

  [柱外效应]

  柱外效应(即进样阀、色谱柱及检测器间的管路过长、直径过粗、管路接头不匹配、有死体积)是影响色谱柱柱效的主要因素之一。所以在可能的条件下,色谱柱的两端连接管路要尽可能短,连接管内径尽可能细小,切口务必平整光滑,尽可能的减小死体积,以防止因样品扩散造成不能反映色谱柱真实柱效等情况发生。

  [缓冲不足或不合适]

  在缓冲不好或离子强度过低的分离中,也会出现保留时间重现性差和峰形拖尾。增加缓冲浓度(与样品大小相匹配)能改善此情况。

  [硅醇基团作用]

  仔细分析色谱柱内填料表面性质可知:反相色谱柱填料的表面大约被键合相覆盖了一半,其余的就是未被键合的硅醇基团。所谓的保留是指样品分子与键合相相互作用的结果。但是,酸性或碱性化合物与硅胶表面残存的硅醇基团或金属杂质之间相互作用而引起双重保留机理,因此,发生了峰形拖尾。

  为了减小峰形拖尾,通常可在流动相加入25mM三乙胺(抑制剂)。三乙胺能与硅醇基团发生强烈的相互作用,从而降低或阻断样品分子与硅醇基团的作用,以保证保留机理正常进行,并大大缓解了峰形拖尾。使用长链的硅醇基抑制剂,虽起效较慢,但持续力较三乙胺长。因为抑制剂分子中除了胺基与硅醇基团发生极性作用外,大分子中非极性部分与固定相也会发生反相作用而产生保留现象。如果将抑制剂加至样品中,效果会显著。

  [柱内金属污染]

  柱内金属污染(Fe,Ni等)可引起某引些化合物峰形拖尾。金属可由填料本身带进,也可由腐蚀性流动相缓慢溶解柱进口的金属滤片,随流动相沉积到柱填料中。例如C18柱填料被金属污染后,造成酸性/碱性样品拖尾,可用碱洗/酸洗后再键合的填料,得到的峰是尖锐且对称的。


  88、流动相与柱子如何才能做到匹配,达到最好的分离效果。目前我们实验室有购买好的色谱柱,可是对样品的分离效果不是很好。

  答:不同填料的色谱柱都有自己的选择性,相同填料不同厂家以及相同厂家不同品牌之间的选择性都是不一样的,一般情况下根据物质的性质将分离的大方向如:正相分析或者反相分析,确定后,一般可以根据调节色谱条件能得到好的色谱峰形,这方面的资料论坛当中很多,但是也有些色谱柱不管怎么调整色谱条件都不行,表面这款色谱柱的选择性不适合该样品的选择。


  89、我用的是C18柱,后面黑色的是我以前跑的图,前面是我现在跑的图形,完全一样的东西,只是流动相不是一批配的(流动相的成分没变),中间柱子别人用过了,峰型怎么发生了这么大的变化啊?可能的原因是什么啊?是不是柱子出了问题啊?

  答:从两个图对比很明显可以看出是柱效严重下降,且伴有肩峰。不同时间配的流动相,如果成分和pH没变的话,肯定不会造成这个结果。估计是别人用柱子过程中,造成了柱头塌陷、柱头污染以及固定相流失等严重问题,如样品太脏,流动相或样品pH太高或太低,都会造成这个结果。

  你可以试着用色谱柱清洗和再生的方法反冲维护一下,但不能保证一定能回到原来的效果。再生如果不行,考虑挖补柱头填料,实在不行,柱子也只能报废。建议柱子最好还是专门用于一种方法比较好,像你这种情况,都搞不清别人怎么用柱子的,分析解决问题就相当难。


  90、柱子的柱效影响大吗?一般柱子的柱效规定是多少的呀!理论塔板数一般要达到多少呢?主要有那些因素影响它。

  答:柱效是柱子性能好坏的一个重要体现指标。柱效会影响分离度,当然是峰形越尖锐,柱效越高,和其它峰越容易分开。另外柱效高峰形尖锐,对峰面积的积分误差就小,甚至可以用峰高来定量。

  一般C18柱,在测定甲苯等不易拖尾的小分子中性不电离物质时,5um的填料,每米的柱效能达到80000以上的塔板数,就算合格吧。在实际分析物的测定时,一般药典有规定最低柱效是2000-3000,一般新柱子的柱效都高于这个数。但柱子在使用后,由于固定相流失等原因,柱效会逐步下降,当下降到不符合药典最低柱效要求,或者导致分离度不够时,色谱柱就算寿命到了。单从柱效逐步下降这个角度看,柱效高的色谱柱相对使用寿命更长。

  影响柱效的因素有粒径、粒径和孔径分布、固定相键合密度、柱外体积和温度等,柱子装填紧密、柱床均匀一致也对提高柱效有好处。这些影响因素中,很多是和生产厂商有关,你这边能做的是尽量减少柱外连接体积。


  91、流动相中加入四氢呋喃对柱子有损害吗?我现在分析一样品流动相中用到20%的四氢呋喃才能把峰分到基线.但柱子只能用一个星期分离效果就不好了.请问是四氢呋喃损坏了柱子吗?

  答:四氢呋喃(THF)是反相色谱中洗脱能力极强的溶剂,比甲醇和乙腈都强很多。在流动相中加入THF能改善某些难分离的物质对的分离度。但THF不稳定,容易降解生成具有很强反应活性的过氧化物,能与分析物反应生成新化合物,导致拖尾、峰分裂和鬼峰产生。高反应活性的过氧化物还可以和填料固定相发生化学作用,THF对柱子有损伤这点是无疑的,而且这种损伤是随时间累积的。THF保质期一般规定是6个月,放得越久,里面产生的过氧化物含量越大,你应该避免使用生产日期已很久的THF溶剂,而且最好将THF冷藏、干燥和避光保存,使用前最好能检测一下过氧化物的含量。


  92、在用液相色谱同时分离多种组分时,怎么通过条件色谱条件使各个峰达到比较理想的分离效果!

  答:这是方法开发的大问题。方法开发建立,要做的就是:针对分析物和基体的情况不同,选择色谱柱类型和分析条件,包括流动相溶剂类型、组成比例、pH值、温度和流速等参数的确定。这方面的问题,要讲起来内容非常多。


  93、是样品过载问题,按药典检测方法检验一些药品有关物质时,都要注入高浓度的供试液,这样往往使得柱过载而峰变形,按老师的方法减小浓度和注入量均是不允许的,怎么处理这问题?

  答:药典方法中注入高浓度供试液测定有关物质,提高注入浓度是为了把杂质峰的信号增强。有时候为了把杂质峰显现出来,主峰因过载有所变形,如在允许范围内,也能接受。但前提是杂质峰和样品主峰分开,如果因过载而使两峰没有得到需要的分离度,杂质峰信号再强也失去了意义。我认为药典规定的条件是允许在一定范围内进行调节的,因为药典没有规定具体使用色谱柱的品牌,而不同品牌的柱子,上样量是有差异的。对色谱条件微调,并取得到了很好的分析结果,如果规定不允许,那你首先要怀疑这个规定是否合理,或者是否对规定的理解有问题。


  94、哪些原因会造成色谱峰变宽、峰高变低,有哪些解决办法?

  答:确实是这样,如果其它色谱条件没有改变,柱效下降是导致峰变宽的主要原因。对于易电离的极性物质,如果流动相pH选择不合适,分析物既有中性分子态存在,又有离子态存在,峰也会变宽变矮。

  色谱柱使用后柱效逐步下降是正常现象,如突然降低则属异常。柱效下降原因有很多,但柱效快速下降则多半是使用不当,造成填料特性或柱床结构改变所致。如超过使用pH范围造成的固定相和硅胶基体的流失、柱床塌陷等;还有强保留物质吸附在填料表面,形成非特异性吸附层,完全改变了原有固定相的表面活性和分离性能,使柱效下降;另外进样时的压力脉冲,也会破坏柱床结构影响柱效。


  95、我以前做苏丹红用的是安捷伦的SB-C18柱,峰形什么都很好,最近发现4个标样峰后都带有一个小峰,一开始以为是标样问题,后来换XDB-C18后标样又正常了。可是用SB-C18柱做其他用正常,不知怎么回事?还有,像这种C18柱如果压力过高能不能反冲,该如何冲洗?一般做兽残、农残什么的,而且感觉三聚氰胺做后压力更易增高,且容易引发进样器漏等问题,请问做完三聚氰胺需对系统做特殊清洗吗?

  答:用SB柱,标样后带一小峰,而且是只对苏丹红标样测定时有,估计和苏丹红标样的测定方法和其它样品测定方法不同有关。最好能把谱图贴上来看看,是什么样的小峰?才能判断是溶剂峰还是杂质峰。XDB柱和SB柱是有区别的,XDB键合度高,封尾良好,反相保留能力强;而SB柱,未进行封尾,对极性物质选择性好。有可能你的苏丹红标样分解了,有极性杂质生成,SB柱能把杂质分开,而XDB柱不能。

  这两款柱子压力大了,可以反冲。有正常维护时的反冲冲洗和再生时的强溶剂冲洗两种,冲洗方法在在线讲座里也写了,你再回到本贴的前面看看就可以了。

  三聚氰胺和三乙胺类似,本身容易和硅醇基作用而吸附在填料表面,另外三聚氰胺测定的样品基体含蛋白类的强保留物质较多,容易污染色谱柱柱头引起填料间隙堵塞柱压升高,最好每次做完样后,都用甲醇或乙腈反向清洗维护一下。如有蛋白类的污染,也定时用本讲座中提到的清洗方法做一下维护。


  96、我是做农药残留分析的,不同的基质杂质含海量是不同的,我用C18分析时有可能一次就污染了,我用高流速,和反向冲洗都解决不了,是不是这根柱子就废了,有没有其他的办法?

  答:高流速反向冲洗是对的,关键你用了什么溶剂冲洗呢?用原来的流动相冲洗肯定不管用,要不然就不会累积在柱子上了。你应该用流动相中的强溶剂B冲洗,如果不行,就需要启用再生的程序,当然再生时用的溶剂更强。

  100%甲醇---100%乙晴---75%乙晴/25%异丙醇---100%异丙醇---100%二氯甲烷---100%正己烷

  用每种溶剂冲洗至少10个柱体积,对于250mm×4.6mm的分析柱,合适的冲洗流速是1~2ml/min。最后用10柱体积的异丙醇过渡,然后回到原来的流动相体系。

  再生还不解决问题,最后一招就是挖补柱头填料,把柱头污染的填料挖掉,用干净填料填补进去。挖补填料,破坏原有柱床结构,挖补后柱效也不可能有新柱水平,或许能再维持一段时间,但不会长久。


  97、还有溶剂中的金属过滤头生锈了,会有什么影响?会不会影响到柱子的寿命,金属离子和柱子有没有什么反应?

  答:我觉得你就把锈当成颗粒物污染的一种,会导致拖尾、柱压上升等。溶解的金属离子一般在反相柱上没有什么保留能力,马上就会被冲出柱子,不会和固定相或者和硅胶基质反应。


  98、如果在溶剂过滤时把水膜当成有机膜了溶解了而且这样的溶剂又做有机相用了,造成C18柱压由1000升到3000,流动相是乙腈和水,问一下这样的柱子还能用么?有没有什么补救方法?

  答:溶解的膜作为了颗粒物堵塞筛板,引起柱压上升,也只有反冲一下,如果能把堵在筛板上的膜残渣冲走,柱压下降了就OK了;如果残渣进入了柱子内部的填料间隙,会难冲一点,也只能多冲一会吧,实在不行,你又舍不得把色谱柱报废,就只有挖补柱头填料和换筛板了。


  99、保护柱和预柱的作用是不是一样的,如果不一样有什么区别么?保留时间漂移多少为可以接受的范围?

  答:保护柱一般带填料,相当于一根缩短了的色谱柱(一般是1-2cm长度),卡套里可更换的柱芯,柱管、筛板和填料都有。保护柱里的柱芯好像是在前面开路的扫雷部队,流动相和样品里如有什么损害柱子的污染物,保护柱就自己承受了下来。

  而预柱,现在一般指的就是接在进样器和色谱柱之前的在线过滤器。在线过滤器和保护柱的最大区别是不带填料,只有可更换的筛板。预柱只能保护色谱柱免受颗粒物质的污染,而不能阻挡溶解在流动相中的强保留物质。

  保留时间是液相色谱中一个很有用的诊断分离问题的工具。保留时间受流动相组成、温度、pH、流速、固定相流失和柱老化等很多因素的影响,如果所有这些参数保持不变,保留时间也保持恒定。但在实际操作中,不可能对每个色谱参数进行很完美的控制,如即便加了柱温箱,温度还是会有波动;流动相组成会因组分挥发性不同而改变。

  所以保留时间有上下0.02-0.05min的变动是非常正常的,对某些方法有0.1min上下变动也属正常。保留时间有大的变化,预示着系统和方法存在问题。流路里有气泡存在,泵阀有泄漏,会因流量降低而导致保留时间增加。梯度混合比例阀故障也是保留时间变化原因之一。


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