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【药研分析】药研兵器谱之C18柱——选对定海神针,选错朽木一根
发表于:2019-07-22 浏览:751

  写在前面

  随着 4+7 带量采购方案的实施,制药企业愈发重视新药研发和创新,也对药物分析工作提出了更高的要求。分析不同的样品时需要采用不同的柱子,而柱子的选择却难倒了不少“英雄汉”:

  * 有时候样品在这根柱子上分不开,换一根也分不开,再换一根还是分不开

  有时候发现两根 C18 柱子上的分离结果有着天壤之别

  有时候使用速度更快的柱子,却又不太习惯

  C18 柱,也叫ODS柱,是分析工作中使用最多,应用最广的液相色谱柱,占据了液相色谱柱的半壁江山。正如世界上没有两片完全相同的树叶,也没有两款一模一样的 C18 柱,如何在市场上繁杂的 C18 柱中寻找到适合自己分析的那款,是一个值得深入探讨的话题。

  今天,小编整理了各种 C18 柱的异同,并帮助分析工作者在日常工作中更好地选择合适的色谱柱。


  液相色谱柱分类 — C18


  液相色谱柱根据极性分为正相柱和反相柱。

  正相柱大多以硅胶为柱,或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱;反相柱填料主要以硅胶为基质,在其表面键合非极性的十八烷基官能团(ODS),称为C18柱,其他常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。


  液相色谱柱的使用 — C18


  1、适用pH范围

  反相柱优点是固定相稳定,应用广泛,可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料,使用时一定要注意流动相的PH范围。一般的C18柱PH值范围都在2-8,流动相的PH值小于2时,会导致键合相的水解;当PH值大于7时硅胶易溶解;经常使用缓冲液固定相要降解。pH过高或过低还可能会损坏密封圈和柱塞杆以及色谱柱,更严重的是当PH大于9.5时会破坏流通池的石英玻璃。如果发现上述情况,色谱柱入口会发生塌陷。

  2、样品的前处理

  a.最好使用流动相溶解样品;

  b.使用针头过滤器(0.45um滤膜)除去样品的可见异物。

  3、流动相配制

  a.流动相对样品具有一定的溶解能力,并且保证样品不会在色谱柱内析出或长时间留在色谱柱内;

  b.流动相不与样品发生反应;

  c.流动相粘度尽量小,使样品得到高效分离的同时降低柱压,延长色谱柱寿命;

  d.流动相沸点不能太低,避免有气泡产生,影响实验进行;

  e.流动相要保证现配现用,不能储存太久,避免流动相生成杂质微生物影响检测;

  f.流动相使用前先脱气。


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  液相色谱柱的表征 — C18


  虽然我们讲的是 C18 的不同,但其实 C18,C18H37 这个基团都是一样的,不一样的是除了 C18 以外的其它各种因素。


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  硅胶颗粒—孔径和比表面


  孔径的大小和比表面是相互影响的,又会进一步影响碳载量,再进一步影响保留、分离、载样量以及稳定性。


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  键合相


  碳载量

  测试得到的碳载量是包括了填料中所有碳的百分比,但仅仅 C18 键合相上的碳才是最有意义的碳,所以键合相密度更能有助于比较不同载体填料的 C18 的量。对同类型的填料而言,大多数化合物在高碳载量柱子上保留因子大于低碳载量的柱子,但碱性化合物这样强极性的化合物除外。


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  封端与修饰

  封端有着诸多的好处,但也有一些坏处,因此各大色谱柱公司推出色谱柱的封端的程度,都是对各种情况的一种平衡。极性修饰的 C18 能够引入更多的作用力帮助分离,而不封端的 C18,是否也能看成某种极性修饰?


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  硅胶类型 — 封端对保留与峰型的影响


  硅胶类型与封端与否的两两组合。封端的B类硅胶峰型最好,不封端的A类硅胶有着最强保留。


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  硅胶颗粒


  粒径 — 高效向左,制备向右


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  一般大粒径填料因为压力低,耐脏,用来做半制备或者制备,而小粒径填料,一方面允许采用更短的柱子来达成所需的柱效,另一方面更能抵抗因为高流速而带来的柱效下降,适合于做高效分析。小的粒径,配合更小柱外体积,以及能够耐受更高压力的仪器,越能够发挥其优势。

  粒径的优劣势对比

  各种粒径的硅胶都有着对应的优缺点,需要结合自身的实际情况才能更好发挥各种颗粒的优势。而其中 5µm、3.5µm 的全多孔颗粒(TPP),以及 2-3µm 的表面多孔型颗粒(SPP),有着最高的综合总分。


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表格来源:LloydR.Snyder,JosephJ.Kirkland,JohnW.Dolan,现代液相色谱技术导论


  Poroshell 是一种趋势


  CHP_硝酸异山梨酯

  以 Poroshell 为代表的 SPP 越来越为各大标准制定机构所接受。2.7µm 的 SPP 满足快速高效分析,但又对仪器、流动相和样品的包容性更优于亚 2µm 的 TPP。

  这是安捷伦和中国药典委联合出版的应用图谱集,15 版的实验已经完成,正在出版中。


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  EP & USP & JP

  在 EP、USP 和 JP 联合协调的一则文件上,明确表示无论是等度,还是梯度,从TPP 改用 SPP 色谱柱是允许的,这也体现了国际主流药典机构的认可。


  键合相+硅胶 — 作用力与疏水减法模型


  疏水减法模型是覆盖面最广的,用于评价各种色谱柱与指针型化合物之间各种作用力的模型,目前已经包括了超过 700 根色谱柱,尤其适合 C18 色谱柱的评价。


  色谱柱选择性差异


  Plus C18 与 SB C18


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  Fs 的值表明两根色谱柱之间的总体差异的大小:

  Fs 在 3 以内,两根柱子基本上接近;

  Fs 在 3-10,类似,特别是待测物不多,分离度大于2的;

  Fs 在 35-100,对于非离子型化合物来说,正交;

  Fs 在 100 以上,对于包括离子型化合物的样品来说,正交。

  不同化合物不同pH不同柱子的总体差异

  泛泛来看,B 型封端的 C18 比较接近,B 型硅胶极性封端的 C18 近似但有差异,而A型封端的 C18 有着最大的不同。这张图有助于帮助我们区分各种类型 C18 之间的差异。


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  液相色谱柱的使用注意事项


  1、新色谱柱使用

  a.先用10-20倍柱体积的色谱级甲醇或乙腈由低流速缓慢提高至正常流速冲洗,随后换至10%甲醇低流速缓慢提高至正常流速冲洗 ;

  b.分清色谱柱方向;

  c.尽量在色谱柱前段加保护柱,并定期清洗保护柱。

  2、色谱柱冲洗

  使用完毕先用10%甲醇/水冲洗,如果长时间不用再用纯甲醇冲洗、保护。(一般情况下,10%甲醇/水低流速冲洗过夜)

  3、色谱柱再生

  用相当于20倍体积的溶剂按顺序冲洗柱子,尽可能按照色谱柱箭头方向冲洗,尽量不反冲:10%甲醇/水溶液→甲醇 → 氯仿(或异丙醇)→甲醇*或用热蒸馏水(55℃)+四次注射100ulDMSO 。


  内容来源:安捷伦

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