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【药研杂记】江湖秘史,色谱柱内径缘何非整数,药研君一文谈笑破天机
发表于:2019-08-23 浏览:391

  药研君想问问大家,在做液相的时候是不是也有人有这样的疑问:

  为啥色谱柱的内径都不是整数的数字?

  比如:4.6mm;2.1mm!从来没有见到过5mm,10mm这种看上去让人赏心悦目的整数。

  那么,是不是设计色谱柱的人脑子进了水,非要挑些奇怪的数字来消遣大家...看样子,明显不是,大家会发现,市面上大部分的色谱柱都是这些奇怪的内径规格,反而是那些带着整数值内径的色谱柱好像看上去和大家格格不入成为了异类。


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  到底是为什么?这一定是有什么原因的...那么原因是什么呢?


  范德米特曲线


  在液相色谱的基础理论中,我们总会听到一个如雷贯耳的名字,他叫范德米特,为了简便,我们称呼他为老范,他曾经在纸上画了一个对钩,用来解释色谱柱的柱效和流速的关系,后来,这个对钩出名了,被叫做“范德米特曲线”,成为了液相色谱分离当中最经典的理论之一。


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  上图是不同粒径的范德米特曲线,不过这里我们以5um填料色谱柱绘制的范德米特曲线为例,为啥要选5um填料?主要是因为这个规格的填料从上世纪80年代产生,90年代兴盛到现在仍旧老当益壮经久不衰,堪称经典,另外,5um填料的范德米特曲线是个非常周正的对钩。


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  那么我们来解释一下这个经典的对钩吧,它被画在一个坐标轴里,横坐标表示谱带移动的线速度,纵坐标表示理论塔板高度。纳尼?线速度,理论塔板高度,这都是嘛(四声)?

  这两个词确实生僻。所以,我们可以把它们近似地理解为:流速和柱效,对于给定的一根色谱柱(长度,填料粒径固定)越大的流速能产生越高的分析速度,越小的板高能产生越大的柱效;所以,在老范的对钩当中,横坐标数值越大,分析速度越快;纵坐标数值越小,柱子的分离效果越好。


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  知道了这些,我们就大概能理解老范画的这个对钩代表的意思了:对应一根固定的色谱柱:柱效随着流速提升而升高,到达一个最大值以后,又开始随流速增大而降低,这个让色谱柱达到最大柱效的流速值,被叫做最佳流速,在最佳流速附近保证实际柱效与最佳柱效差异很小的一个区域内的流速,被叫做最佳流速范围。所以老范的对钩的深层意义就是:谁在最佳流速使用色谱柱,我就给谁画个大对钩。


  流速与内径


  扯到这儿,一直在说老范和流速的事儿,还没和内径扯上一点关系,接下来,我们就要给老范和流速牵线搭桥了,这个牵线搭桥的人就叫内径。


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  在老范的大对钩中,横坐标叫做线速度,我们近似地把它认为是流速,其实,在“近似”的过程中,我们省略了内径这个因素,或者说是色谱柱粗细的影响。

  线速度指的是色谱峰谱带移动的速度,通常用cm/min作为单位,

  而流速指的是色谱仪输液的体积流速,通常用mL/min作为单位。

  举一个生活化的例子,就是汽车,线速度可以理解为汽车行驶的速度;流速可以理解为汽车烧油的速度,而不同内径的色谱柱,可以理解为不同大小的汽车,越粗的色谱柱代表着越大的汽车,要开到相同的速度,烧的油就多,所以,更粗的色谱柱需要更大的体积流速才能产生与细色谱柱相同的线速度/分析速度。

  返回头看老范给画的大对钩,找个尺子一比,发现对于5um填料的色谱柱,最佳流速对应的是大概6cm/min这一点,不过,这是线速度,我们用的色谱仪都是需要设定体积流速的,刚才我们说过,体积流速和色谱柱内径是有关的,那么问题来了:色谱柱内径哪样好?

  在这个问题上,设计色谱柱的人没有随便设计个1,2,5,10mm这种自己看了爽大家又喜闻乐见的内径数字,在这个问题上,他们秉承了“业界良心”。


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  大家想想看,自己在色谱仪上输入流速的时候,是输入1mL/min的感觉爽还是输入1.18mL/min的感觉爽?我相信,只要不是自虐倾向太强的同学,一定都会觉得是1mL/min更爽些...1mL/min对应的是4.6mm内径色谱柱的最佳流速,而1.18mL/min对应的是5mm内径色谱柱的最佳流速(都是说5um填料的色谱柱)。

  现在大家明白为啥我说色谱柱的设计者有“业界良心”了吧,为了让大家在使用的时候爽,他们宁可让自己在做柱子的时候“不爽”,这是怎样的国际主义精神啊~

  后来呢,随着仪器的进步,仪器能控制的流速精度越来越高,所以,出于对流动相节省和质谱兼容性等等的需求,也开始出现了内径更小的色谱柱,在这些柱子的设计上,仍旧秉承了一贯的业界良心,尽可能让大家在仪器控制的时候输入一些更“整”的数字,所以色谱柱的内径仍旧是不太规整的,3.0mm对应0.4mL/min,2.1mm对应0.2mL/min,1.0mm对应0.05mL/min(这个貌似两边都挺整,简直是强迫症患者的福音啊~不过,其实这个规格的色谱柱远没有其他规格的填料种类全...)

  后来,UHPLC出现了,老范的对钩明显走形了……


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  我们能看到,UHPLC对应的最佳流速已经明显和5um的HPLC填料不同了,按照刚才的业界良心理论,UHPLC色谱柱的内径也应该应对变化以继续让大家爽,可但是,我们看到的UHPLC色谱柱的内径规格还是那老三样:4.6,3.0和2.1。


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  难道是世风日下,业界良心一去不返了?

  别慌,回过头再用尺子比比老范的发福版对钩,我们会看到,对于UHPLC的最佳流速,大概是在12cm/min这个地方,而且,由于UHPLC最佳流速范围的扩展,经典HPLC的最佳流速数值仍然在最佳流速范围内,所以,即使我们不改变内径和流速,UHPLC的柱效也是很好的,如果要追求最佳流速,只要把原来的流速都乘以2就差不多了,1变成2,应该也不会造成什么不爽...


  大内径色谱柱


  我们已经了解了造成色谱柱内径数字不是整数的原因,刚才我们稍稍提过一下,小内径色谱柱的出现是出于溶剂节省和质谱兼容性的原因,那么大家会问,既然小内径色谱柱有这些好处,为啥还没有取代大内径的色谱柱?下面来大概解释一下吧:

  1、大内径色谱柱可以承载更大的上样量

  利用这个特性,我们可以进行色谱制备纯化,用很大内径的色谱柱,一次进样就可以纯化很多样品,还是用汽车做个例子,大公交比小面包可以装更多的人。

  2、大内径的色谱柱有更好的抗“溶剂效应”能力

  通常即使溶剂兼容性不是那么好的情况下,大内径色谱柱更容易得到更好的峰型。

  3、大内径色谱柱对仪器的系统扩散耐受能力较强

  由于使用较高流速分析,大内径色谱柱由于仪器死体积造成的柱效损失会更小,而小内径色谱柱对死体积格外敏感,这也是是为什么现在的窄径柱(内径小于等于2.1mm)都推荐使用在高性能的UHPLC仪器上的原因。

  4、大内径对仪器的延迟体积影响相对不太敏感

  主要也是由于使用高流速,可以尽量抵消延迟体积带来的影响。

  5、大内径可获得更高流速

  对于某些型号的仪器以及某些特殊的方法,高流速下容易获得更好的混合精准度,这主要是由于仪器的硬件性能限制导致的。

  所以呢,色谱柱内径大小的选择和使用,完全是要根据自己实际需要来选择的,在某方面表现好,必然会有某方面的牺牲,尺有所短寸有所长,根据自己的仪器方法和实际需要选择合适内径的色谱柱才是正道。


  内容来源:试验与分析 编辑:小析姐

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