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【药物分析】色谱手动积分门道多,不懂这些原则可不行...
发表于:2019-09-03 浏览:1091

  说到气相色谱,积分可是大事,今天我们就讲讲积分的故事…

  在我们要对色谱峰进行积分计算之前,得先了解几个概念:


  定义


  1、积分

  指在信号中确定峰并计算其大小,积分包括以下操作及步骤:识别、校正、定量。

  2、积分事件的参数控制

  对于某个信号进行积分时,软件将识别每个峰的开始和结束时间,并用竖线标记这些点,寻找每个峰的峰顶点,确定保留时间/迁移时间,建立基线,以及计算每个峰的峰面积、峰高和峰宽。这些过程积分事件的参数控制。

  3、自动积分

  自动积分功能为设置初始事件提供开始点。自动积分功能设置以下参数:初始斜率灵敏度(阈值)、初始峰高、初始峰宽、初始最小峰面积。

  4、手动积分

  此类型的积分允许对选定的峰或峰组进行积分,在指定的手动积分范围内,将忽略此软件的事件积分(初始最小峰面积除外)。如果手动积分出来的一个或多个峰低于最小峰面积阈值,则此积分将被废弃。手动积分时间使用绝对时间值。它们不会为信号漂移作调整。

  在报告中,手动积分提供以下功能:

  § 划基线:指定为一个峰或一组峰划基线的位置;

  § 负峰:指定何时将基线以下的面积当作负峰处理;

  § 切线撇去:计算从主峰切线撇去的峰面积;

  § 分裂峰:指定用垂线分裂峰的点;

  § 删除峰:从积分结果中删除一个或多个峰。


  积分参数


  自动积分主要是修改以下4个积分参数实现的,具体如下:

  1、斜率灵敏度(Slope Sensitivity)

  也称阈值,指设置信号斜率的值,该斜率用于识别积分过程中峰的起点和终点。如何信号斜率大于“斜率灵敏度”值,将建立峰起点,如果信号斜率降到“斜率灵敏度”以下,将建立峰止点。

  设置值越低,峰响应越灵敏,当然,不同品牌的仪器对设置值的响应程度会有所区别。

  2、峰宽值(Peak Width)

  用于控制积分器的选择性以区分峰与基线噪音。如果设置的初始峰宽太小,则可能将噪音当作峰。如果宽峰与窄峰混在一起,可以选用运行时间编程事件设定特定的峰宽。

  3、最小峰面积值(Area Reject)

  根据峰面积来设置小于目标峰面积的峰将不被积分也不会报告;

  4、最小峰高(Height Reject)

  最小目标峰的高度,任何小于最小峰高的峰将不被积分及报告。

  了解完概念,咱们说说如何进行积分计算?首先看一张图:我在峰底下画根线,这个线就是告诉软件那个部分需要计入峰面积的计算。


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  我们说过,美图软件最简单好用容易上手,所以,大部分时候,我们的美图软件能自动帮我们画线。

  这就是说,我们的软件能够比较准确的指认出色谱峰,但是有些时候,软件会犯傻,出现一些神作…

  各位可能不知道,去韩国整容,大夫是要要先打草稿的,这一条条的线,就是草稿,草稿打的好,以后效果才好,所以,别小看这一堆线,这是成功的关键。


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  计算的效果如何,就全看这根线画得准不准了,那么,这个线到底该怎么画…


  积分计算


  首先,我们得知道到底怎么把一个“峰”认为是一个峰: 其实软件看判断峰是不是峰是有“套路”的,有一些指标的。靠一些数字阈值来确认的,关键的一些指标可以参考下面这个表。


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  这个表叫积分参数表,各家软件里一定都有,而且对各个参数的指认也有不同的算法和单位,都说出来太乱,而且估计大家也懒的看,总结了一下,软件看峰的标准就是:

  太陡了不积,太缓了也不积;

  太小了不积,太大了也不积;

  太矮了不积,太高了也不积;

  太胖了不积,太瘦了也不积;

  不让积的时候,坚决不积。

  知道了这些套路,还怕啥子积分,当然,这还有什么其他用呢?

  如果峰长得太丑,会不会给积分呢?当然不会,软件不认啊,当然也不给积分了。

  那如果,长得特别丑的峰被积分了,怎么办?嘿嘿,你懂的,暗箱操作,改规矩呗...

  修改规则这个事儿,在咱们的软件里,叫做调整积分参数,目的就是让咱们把那根线划得刚刚好,让想积分的峰积分上,这是一个很有技巧的事情,尤其是对于一些长相奇葩的峰,这条线怎么划,就更是有学问了,咱们画几个线,大家自己感受一下哈!


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  对于这样不太合格的峰,如果我们能调节参数让积分线尽量能吧这些峰画出来,那也就能勉强挤入选择范围了,这种修改积分规格的情况叫做,手动干预,当然,软件越高级,划线的手法也越厉害,比如上面的图和下面的图其实都是同一种情况,但是软件如果厉害点,就会把直的积分线掰弯,让面积计算更准点。 但可是,很多时候,我们不管怎么调,都找不出一个合适的组合将特别丑的峰积分,这个时候,该怎么办?这个时候,我们就该用更深的套路了,指定那个特别丑的峰必须积分…强行在那个特别丑的峰上划条线…这个行为,叫做“手动积分”,这是积分界的大杀器,它说积谁就积谁,就是这么霸气。

  虽然霸气,但是麻烦也很多…尤其在法规实验室这种监管森严的地界,一旦出现修改规则的事儿,要是没有能让人信服的理由,那事情可就闹大了。 而管这个事的就是大名鼎鼎的FDA。


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  积分步骤


  记住,这是一张套路图,是不是有点像十字路口?是不是看着有点晕?没关系,咱们来慢慢分析。。。

  第一个路口,在软件自动积分完成以后,如果根据我们数据处理方法中预设的积分参数得到的计算机过一切正常的话,皆大欢喜,分析完成出报告

  如果,你发现了一点小问题,比如有些峰没有被正确的积分出来,这个时候,我们就要走到第二个十字路口了,这些峰,到底是积还是不积…


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  到底该走哪边,主要还是看峰没有被正确积分的原因,比如由于分离度或灵敏度低导致的峰没有正确指认,基线漂移导致的误判,保留时间微小变化导致的误判,峰型变化比如拖尾导致的误判等。。。当然,这些都是可能原因之一,具体什么原因,这需要各位根据自己实验室的要求和方法的具体情况具体判断,但是,有些情况是绝对禁止的:那就是好好的一个峰,但是非要乱划线以使它能够满足系统适应性或者测试结果标准要求的情况。比如图里画问号的两条线,这种故意把线划歪导致峰面积增加或减小的,这就是等于故意玩黑幕。


微信图片_20190903100413.jpg


  经过这个路口,基本我们的数据的命运就决定了,被淘汰的,就要启动实验室调查了,而有些峰,还有一次机会被重新审查,进入手动积分阶段,不过,到底是小改干预一下,还是要玩大的颠覆规则,那就要看峰自己的造化了

  第三个路口,如果峰的毛病不大,只是暂时发挥失常,我们只要稍微调整下积分参数的设置就可以让他们重回正常的积分状态,那我们只需进行手动干预就可以

  比如由于保留保留时间微小漂移的峰,我们可以适当调整时间窗口,或者是由于灵敏度问题的峰,我们可以适当调整峰高接受的阈值,他们就可以被正确积分。

  但是有些峰,走型比较严重,比如比较严重的拖尾或者基线漂移,实在是超出了软件自己解决问题的能力,那这个时候,我们只能亲自操刀来划那条线了,这个事情很重要,必须要亲历亲为,小心谨慎。

  这遍套路,听着讲下来,好像挺流畅,不过,好脑子不如烂笔头,在实验室里,一定要把套路记录下来,形成自己门派的独门秘籍,这个独门秘籍,就是SOP,关于手动积分,如何判断,如何使用,自己的实验室里一定要结合自己的标准和情况制定一个SOP,这个SOP里一定要说明:重新积分的原因,这是针对第一个十字路口的允许重新积分的情况,这是针对第二个十字路口的,任何不满足的这些情况的数据,不应该重新积分,而应该启动实验室调查。


  重新积分使用的原理和方法


  SOP犹如武功秘籍,不过接下来,要想练功,使用这个SOP,还得遵守一些江湖规矩:重新积分的操作要经过相关权限人员管理者授权后才能进行,并且需要具有相应权限的人员进行操作,所以,进行手动积分操刀的,一定得是行家。

  所有偏离SOP的偏差都应该在分析报告中讨论,这叫亡羊补牢,避免下次走上同一条不归路。

  色谱积分参数和重新积分的情况,初始和最终积分数据都应该在实验室进行记录并且经过复核,归档保存,这是为了留下证据,防止以后死无对证。

  这么一看,要想搞定手动积分,还真是要花上不少心思,所以,建议就是:与其潜心钻研怎么搞好手动积分,写好SOP,遵守规章制度,不如当初把方法做好一点,把可能分不好的峰都分开,峰型不好的给调好,选好合适的梯度和检测波长减小基线漂移等等,这样可以达到一劳永逸的效果。


  内容来源:液相达人馆 小析姐编辑

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