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【药审佳文】有关物质研究有疑惑?听药审老师解析新药有关物质定性研究
发表于:2020-01-15 浏览:350

  摘 要

  化学药品新药研究中, 有关物质的定性研究具有重要意义, 但目前国内有关物质的定性研究水平与国外先进国家相比有较大的差距。现对新药研究中有关物质定性研究的几种方法进行介绍。

  有关物质研究一直是化学药品新药研究和技术评价中的重点和难点。随着对有关物质认识的不断深入, 对有关物质的技术要求也在不断提高, 其中对有关物质进行定性(鉴定)研究已经成为有关物质研究技术要求的重要组成部分, 受到广泛关注。但目前国内有关物质的定性研究仍是薄弱环节, 研究水平与国外先进国家相比有较大的差距, 这限制了我国药品研究的水平和药品质量的提高, 需要引起研发者的充分重视。


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  研究有关物质定性的意义

  在新药研究过程中, 对药物中的有关物质进行定性研究具有重要意义。通过对有关物质的定性研究, 我们可以获得有关物质的结构信息, 分析了解其形成过程, 合成时可设法避免该杂质的形成, 或经纯化使之降至可接受的水平。另外, 还可以通过检索毒性物质数据库获知该杂质的毒性数据, 为其限度的确定提供有力的依据。同时, 定性研究也是分析方法确定的重要参考, 对贮藏条件的确定也有指导意义。如果不了解有关物质的结构, 后续的研究将无法继续进行。

  对药物中的有关物质进行定性分析也是我国新药研究与国际接轨的需要。按照ICHQ3A/Q3B指导原则以及2005年SFDA《化学药物杂质研究技术指导原则》的要求, 对药物中超过鉴定限度的有关物质皆应明确其来源, 并推测可能的结构。但目前我国的药物研发尚未能做到这一点, 要想与国际接轨, 就必须在有关物质研究的完整性和规范性上符合相关的要求。


  有关物质定性研究的方法

  按照研究方法的不同, 有关物质的定性研究可以分为理论推导法、直接测定法和间接测定法等, 在实际的应用中, 这几种方法常常结合使用, 相互印证。一般而言, 由于有关物质的定性研究不能像原料药的结构确证一样提供全面的信息, 因而需要尽可能采用多种方法(直接测定法例外), 提供尽可能多的信息和证据, 否则, 有可能得到错误的结论。下面对几种方法分别进行说明。

  2.1理论推导法

  理论推导法是通过分析化合物的结构及其合成路线, 推测可能产生的杂质, 是获得有关物质定性分析极为重要的手段, 也可以给其他方法提供重要的指导。通过理论推导, 我们可以对药物的杂质谱类型有一个初步的了解, 对于后续的测定非常重要, 因此, 理论推导法也可以称为杂质谱分析。需要强调的是, 由于理论推导大多需要研究者有较深厚的合成背景, 因而需要质量分析人员与合成人员的密切配合, 深入了解药物的结构特征和详细的合成路线。另外, 由于理论推导需要对合成路线中所有的杂质进行分析, 因此需要了解每一步反应。对于采用外购中间体进行一步或几步反应得到的产品, 由于缺乏必要的信息, 不适合采用理论推导法分析有关物质的情况。理论推导法可以采用以下几种方式。

  2.1.1分析起始原料中可能存在的杂质

  起始原料对于药物中的杂质谱的种类具有决定作用, 通过对起始原料中杂质的分析, 可以推测部分中间体及终产物中可能存在的杂质结构。例如:苯环衍生物的4-位卤化物中常混有1-位卤化物, 以其为起始原料则终产品中可能会生成1-位卤代的副产物。如氟哌啶醇结构为4-氟产物, 通过对其起始原料的分析推测1-氟取代物是其可能的有关物质之一。如图1所示。


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图1氟哌啶醇与1-氟取代副产物


  2.1.2分析中间体杂质

  化学反应一般不可能实现100%的转化, 上一步反应的原料就可能成为后续反应乃至终产品中的杂质。例如:盐酸普鲁卡因的合成, 由于还原反应的不彻底, 硝基卡因混入后续步骤中, 最后成为终产品中的一个主要杂质。

  2.1.3分析副反应及副反应产物

  化学反应往往存在副反应, 因此分析可能的副反应路线, 就可以推测某些杂质的形成途径。分析副反应及副反应产物是推测终产品中杂质类型和结构的最为重要的途径之一。例如:如在某结构中引入反式双键, 如果采用Wittig反应, 则可能会产生一定量的顺式产物, 该顺式产物及其后续衍生物即成为终产品中可能存在的有关物质, 需要进行重点研究和控制。

  2.1.4推测降解产物

  通过对药物本身的性质的分析可以推测可能的降解产物。通过对药物中的不稳定基团和活泼基团进行分析, 可以初步推测药物的降解途径和降解产物。如常见的酯键(包括内酯)、酰胺键(包括内酰胺)、季铵键等不稳定结构以及酚羟基、噻吩基、吡啶基、醛基等活泼基团都容易生成降解物。例如:二肽药物甘氨酰-谷氨酰胺, 在水溶液中易发生环合反应生成环-(甘氨酰-谷氨酰胺), 酰胺键水解后生成的谷氨酸还可能会生成杂质焦谷氨酸, 这些杂质都是质控研究的重点。甘氨酰-谷氨酰胺的降解途径如图2所示。.


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图2甘氨酰-谷氨酰胺与环-(甘氨酰-谷氨酰胺)和焦谷氨酸


  再如:顺苯磺阿曲库铵结构中有酯键和季铵基团, 通过分析其结构即可预测酯水解产物和Hofmann消除反应产物是其主要的有关物质, 需要进行相应的控制。顺苯磺阿曲库铵的降解途径如图3所示


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图3顺苯磺阿曲库铵的降解途径


  2.2直接测定法

  理论推导法仅仅是对药物中可能存在的有关物质结构的预测, 有关物质的结构最终还需要通过一系列的试验测定来确定。测定方法可分为直接测定法和间接测定法。

  直接测定法是直接从药物中分离得到特定杂质, 然后再像原料药结构确证一样通过四谱分析来确定有关物质的结构, 是确定有关物质结构的最直观、最有效的手段之一, 其优点是准确, 提供的证据充分, 如有可能应尽可能进行直接测定。但缺点是:费时费力, 当药物中的杂质种类较多、性质接近时,会给杂质的分离纯化工作带来较大困难, 而且当杂质的量较小时难以获得充足的样品进行测定。

  有关物质的获得还可通过制备HPLC法和TLC法获得, 当有关物质的量较大或与主成分分离情况较好时, 还可以采用柱分离的方法或改变结晶条件的方法获得。

  可以探索通过各种强制降解试验刻意增加某些杂质的量, 也可在合成研究中模拟最差工艺条件进行合成, 以获得尽可能多的杂质进行下一步的研究工作。

  2.3间接测定法

  直接测定法适用于杂质的量较大时进行测定,当样品中的杂质量较小, 且杂质的分离较为困难时,可以通过间接测定法确定杂质的结构。需要指出的是:由于间接测定只能提供杂质的部分信息, 因而需要至少2种以上的间接证据, 并与理论推导法进行结合才能初步确定化合物的结构, 其结构的最终确定仍需要富集一定量的杂质进行直接测定。间接测定有以下几种方法。


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  2.3.1HPLC峰保留时间对比法

  HPLC峰保留时间对比法对有关物质的研究具有重要的意义。在杂质量很小的情况下, 我们首先可以推测有关物质的可能结构, 然后取预测的已知化合物与取含杂质的药物, 在同样的色谱条件下看已知化合物与该杂质的保留时间是否一致。也可以取已知化合物添加入含杂质的药物中, 在拟确定杂质的峰面积是否有变化。

  HPLC峰保留时间法的另一个重要作用是“作标记”, 当新药的临床前研究中显示某特定杂质在多批样品中固定出现, 且在HPLC图谱中位置相对固定,但尚不能完全确定其结构时, 可将其作为“特定的非鉴定杂质”、 , 在质量标准中用相对保留时间(RRT)表示该杂质的情况, 进行后续的毒理学研究和临床研究, 不影响该药物的研发向前推进。待积累多批样品的数据和一定量的样品后再进行定性研究。

  2.3.2UV法UV法

  是利用二极管阵列检测器,观察拟定性有关物质的紫外吸收情况, 并测定该杂质的最大吸收和最小吸收的数据, 初步确定该杂质结构中可能存在的官能团, 也可以与已知化合物进行紫外吸收情况的对比, 为有关物质结构的最终确定提供有用信息。

  2.3.3LC-MS/GC-MS或CE-MS法

  液质/气质联用(LC-MS/GC-MS)[ 5 -6] 或毛细管电泳-质谱联用(CE-MS)[ 6]法是在不得到纯的杂质的情况下获得的该杂质的质谱信息。LC/GC-MS和CE-MS是获得杂质信息的有效手段, 也为定性分析提供较为可信的证据。通过LC-MS/GC-MS或CE-MS我们可以获得各个杂质的可能相对分子质量, 或进一步通过二级质谱[ 7] 获得各杂质的裂解情况, 为解析化合物的结构提供直接证据。

  2.3.4其他新方法

  目前国外还有HPLC/TLCFTIR[8] 和GC/LC-HMR[ 6 -9] 等联用技术, 在不分离杂质的情况下即可获得杂质的傅立叶变换IR图谱甚至是核磁共振图谱, 获得与直接测定法相近的效果, 这些联用技术具有方便、快捷、高效、准确的特点, 是有关物质定性研究的理想方法。目前HPLC/TLC-FTIR和GC/LC-HMR仪器的使用还不普及, 测定方法也有待完善。但由于联用技术的巨大优势,可能成为将来有关物质定性研究的主流方法。


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  张 震, 陈海峰,中国新药杂志2008年第17 卷第19期

  国家食品药品监督管理局药品审评中心

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