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烦人的色谱基线噪音,从这5点入手轻松搞定!
发表于:2019-04-10 浏览:486

基线噪音是做液相的同学经常感到头疼的问题,特别在做痕量分析时候。今天,我们就从物理、化学到电子等各个方面看看噪音的来源,以及如何减小和消除噪音。


1、流动相的在线混合


所有的流动相在线混合都是从方便出发的结果,流动相混合的不充分是基线噪音的一个重要来源。


流动相混合方式主要两种:


01 低压混合

采取时间脉冲的方式,利用比例阀,将不同流动相按一定比例混合。


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02 高压混合

利用多个泵头,控制每个泵的流量,来将流动相按一定比例混合。


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在流动相混合后,一般都有一个混合器(Mixer),来帮助混合的更加充分。


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从流动相开始混合在一起,到流动相到达色谱柱头,这一段体积叫做延迟体积(Delay Volume)。


混合器体积越大,混合越好,但是相应延迟体积就越大,会造成梯度的延迟。


换句话说,就是流动相的变化,需要一定时间后,才能真正到达色谱柱,对分离产生影响。这个现象在使用UPLC或者UHPLC的时候,会有比较明显的作用。


Q: 为什么相同梯度方法,在不同仪器,或者不同品牌的仪器之间转化时,保留时间可能不一样?

A: 其主要原因就是延迟体积的不同在线混合很难做到非常均一的混合效果,这个在示差检测器(RID)上的效果最明显。这也是为什么示差检测器都要求将流动相预混到一个瓶子里,不能走梯度的原因。


那如何减小因为混合而造成的基线噪音呢?


01 对于等度的方法

非常简单,预混流动相就可以了。


02 对于梯度的方法

部分预混流动相也会帮助更好的混合,怎么做呢?看下面的例子。

方法要求乙腈/水比例从10%走到85%。那可以将流动相A配成10%的乙腈,流动相B配成85%的乙腈,然后A/B梯度从0%走到100%。这就是部分预混。


03 增大Mixer的体积

一般mixer的体积从几百ul到几个ml都有,在允许的延迟时间下,更换一个体积更大的Mixer,能够有效提高混合的效率。


每个色生产厂家的Mixer体积都不一样,基本都可以混用。有碰到过一个Agilent的1100基线噪音大,后来换成1050的mixer就好了,因为1050的mixer比较大一些。


2、液相硬件问题造成的基线噪音


1)系统有漏

如果液相系统某些地方的工作不正常,也可能造成基线的噪音。

特别是肉眼无法发现的微漏或者泵的内漏,会造成流速的变化和混合比例的变化,从而导致基线噪音。


压力测试

检查的方法就是对系统进行压力测试:将系统从某个地方用死堵堵上,如泵出口,或者自动进样器出口,将压力升高到350bar后停泵,监测压力下降的情况。
一般的标准是2-3bar/min的下降是正常水平。或者15%/10min的下降。


2)梯度比例问题

可以对系统进行一个梯度测试,来检查梯度混合是否准确和一致。


梯度测试

  • 将A配成0.1%的丙酮,B是水。

  • 在265nm的波长下,将A的比例从10%,20%,30%这样一个一个的升高,每个比例走3min。

  • 可以根据计算,看每个基线台阶上升是否准确。

  • 也可以从0-100%走一个连续的梯度,看基线上升的平滑性和线性。


3、流动相脱气不好造成的基线噪音


对流动相进行脱气,不仅仅是为了防止系统里面气泡的产生。流动相脱气越好,基线就会越好。


如今最常用的脱气方式是在线脱气机,但是有的时候脱气并不彻底。所以当有基线噪音问题时,可以考虑采取多种脱气方式


4、系统洁净程度


前面1-3点讲的都是内在原因造成的基线噪音或者波动。如果你前面的原因都找过了,问题还没有解决,就得考虑一下是不是流动相里面有杂质了


如何检查判断是否是流动相问题?

a. 每次更换一种流动相,看基线结果。

b. 重新配置所有流动相。这种方式比较快,但可能无法找到根本原因。
要特别注意在流动相的配置过程中,是否引入了污染,比如使用了不干净的玻璃器皿什么的。

c. 更换溶剂的品牌和批次也是方法之一。


色谱柱长期使用造成的污染有时候也会造成基线波动。


有些时候样品里面可能有些保留非常强的组分,可能在色谱柱上很长时间才慢慢被冲出来,这时候已经不是一个峰了,而是基线的干扰或者波动了。


避免这种问题的方法:在每次做样后,用甲醇或者乙腈长时间冲洗色谱柱。


另外,专柱专用也是一个好的习惯。如果一根色谱柱上做很多不同的样品,也可能导致互相之间的污染和影响。


5、电路的噪音


对于UV检测器来说,就是采样频率不合适而产生的噪音。


现在随着超高效液相的普及,检测器的采样频率也越来越高,有的可以达到80Hz以上。但是如果一味追求高采样频率,可能对灵敏度没有任何帮助,反倒产生比较大的噪音。


一般来说,我们需要保证一个色谱峰上面有15-20个点,来保证比较平滑的峰形和比较准确的定量结果。


如果我的一个峰的时间宽度是0.5min,就是是30s,那只要保证1Hz的采样频率就足够了。

如果在UPLC上面,一个峰的时间宽度是0.05min,也就是3s,就需要10Hz以上的采样频率。

那80Hz的采样频率什么时候用呢?你的一个峰只有0.5s的时候用。


理论上的计算是这样的:N=16(T/W)^2

N是柱效;T是保留时间;W是峰宽。
一般色谱如果柱效12000的塔板数,在5min的时候,出峰宽度大概计算出来是11s。
你可以根据计算结果来调整检测器合适的采样频率。


上面从理论到实践,从各个方面分析了液相色谱基线噪音或者波动的来源,以及相应排除问题的方法,希望大家也能够分享自己的经验。


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