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【审评老师佳作】色谱系统适用性试验在分析方法使用中的重要性
发表于:2019-10-16 浏览:782

  本文主要以ICHQ2 指导原则为基础,对比了各国药典对色谱系统适用性试验的论述及要求,提出了我国目前在分析方法开发和验证过程中,存在对系统适用性试验认识和研究的不足。

  色谱作为快速、准确、可靠的分析方法,在各国药典中得到广泛应用。色谱方法一般包括纸色谱、薄层色谱、气相色谱、液相色谱、离子色谱、分子排阻色谱、毛细管电泳等。随着对色谱法研究和应用的不断深入,越来越多的研究者意识到色谱系统适用性试验在色谱分析方法中的重要性,尤其是对试验条件( 流动相、不同品牌或不同批号色谱柱、不同品牌仪器) 较为敏感的分析方法。


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  1.系统适用性试验的定义

  ICHQ2中关于系统适用性试验的论述为: 许多分析方法的必要组成部分。该试验是把分析设备、电子仪器、实验操作和被分析样品作为一个整体来进行评价。系统适用性试验参数是根据被论证的方法类型,针对某一特定方法而建立的。通常通过耐用性评估,建立一系列系统适用性参数(如分离度试验) ,以确保该分析方法在任何时候使用均有效。BP 2018 辅助章节( supplementarychapter) SCⅢF.分析方法验证部分内容对系统适用性的论述与ICHQ2B 基本一致。USP41通则〈1225〉药典方法的验证中,对系统适用性的论述为: 如果测试易受测试条件变化的影响,应当对方法进行合理控制或是指明注意事项。评估耐用性就是确立一系列系统适用性参数,以确保不论何时使用,均可维持分析方法的有效性。 液相色谱典型的变动因素有被测溶液的稳定性、不同仪器、不同分析人员、流动相的pH值和组成、不同厂牌或批号的色谱柱、柱温和流速。对于气相色谱法而言,典型的变动因素有不同批号或供应商的色谱柱以及温度、流速等。系统适用性必须基于仪器、电子元件、分析方法操作以及被测物是一个整体的系统。系统适用性试验的参数由所评价的分析方法决定。对于色谱法,系统适用性尤其重要,向USP提交的文件应该注明符合色谱法621中常规测试章节中的有关系统适用性的要求。 《中华人民共和国药典》2015 年版通则9101"药品质量标准分析方法验证指导原则"未对系统适用性试验进行单独论述,仅在耐用性项下提到:经试验,测定条件小的变动应能满足系统适用性试验要求。 对比ICHQ2 以及各国药典通则分析方法验证项下,BP2018 和USP41与ICHQ2 论述内涵较为一致,建立系列系统适用性试验要求的目的是为了确保在任何时候使用该分析方法都是有效的。


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  2.系统适用性的要求

  对比各国药典色谱法系统适用性试验要求,内容基本一致,均包括理论板数、分离度、拖尾因子、重复性和灵敏度。具体要求略有差异,《中华人民共和国药典》色谱法项下系统适用性试验要求更加明确,但目前各论中收载的品种项下的系统适用性要求却是最低的。美国药典通则色谱法项下系统适用性要求并不明确,但在其各论中系统适用性要求却是最多最具体的。这一点也体现了中美研究者对系统适用性试验认识和研究深度的差异。 《中华人民共和国药典》通则0502薄层色谱法提到了系统适用性要求: ①比移值。除另有规定外,杂质检查时,各杂质斑点的比移值Rf 以在0.2~0.8 之间为宜。②检出限。自身对照溶液显清晰可辨斑点的浓度或量为检出限。③分离度除另有规定外都应大于1.0。④相对标准偏差,薄层色谱扫描含量测定时,同一供试品溶液在同一薄层板上平行点样的待测成分的峰面积测量值的相对标准偏差应不大于5.0%,需显色后测定的或者异板的相对标准偏差应不大于10.0%。 通则0512高效液相法提到的系统适用性要求:①理论板数。应指明测定物质,一般为待测物质或内标物质的理论板数。②分离度。除另有规定外,待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应大于1.5。③灵敏度,定量测定时,信噪比不小于10,定性测定时,信噪比不小于3。系统适用性试验中可以设置灵敏度试验溶液,来评价色谱系统的检测能力。④拖尾因子( T) 。除另有规定外,应在0.95 ~1.05 之间。⑤重复性。相对标准偏差应不大于2.0%。 离子色谱法、分子排阻色谱法( 分离度一般应大于2.0) 、气相色谱法、超临界流体色谱法、临界点色谱法等的系统适用性要求,除另有规定外,应照高效液相色谱法项下的规定。

  USP通则621色谱法规定的系统适用性试验要求也包括理论板数、分离度、拖尾因子、重复性和灵敏度,但除100%含量测定重复性外,其他系统适用性参数均未给出明确规定。

  BP2018附录Ⅲ( Appendix Ⅲ) 色谱分离技术中对系统适用性要求也包括理论板数、分离度、拖尾因子、重复性和灵敏度。BP 也仅对对称因子规定为0.8 ~ 1.5 之间,100% 含量测定重复性要求与USP41规定一致,未对其他系统适用性参数作明确规定。

  重新审视一下系统适用性试验的各参数,它们之间并非孤立的,而是相互影响、相互作用、相互关联。分离度Rs 是柱效N的函数; 拖尾因子与重复性直接相关,并在一定程度上影响分离度; 灵敏度是保证上述所有参数有意义的基础。因此,系统适用性试验要求,应该是一个整体的评价,而不是单独对某一个参数的要求。即便是拖尾因子,《中华人民共和国药典》2015 年版指出,除另有规定外,应在0.95 ~1.05 之间; BP2018 规定应在0. 8 ~ 1. 5 之间。但在实际运用过程中,并非所有系统适用性试验要求中拖尾因子都在上述范围内。在某些特殊情况下,是可以突破上述系统适用性的一般要求的。如USP41 收载的二甲双胍片溶出度检测方法3 中,系统适用性试验要求为: 拖尾因子NMT2.0,柱效NLT1500。实验室工作曾经进行盐酸二甲双胍的溶出度研究工作。二甲双胍在较大浓度检测时,容易出现拖尾因子较大的情况。但是,拖尾因子较大不一定会影响检测结果。只要经过研究和验证,能满足检测要求,能保证检测结果的准确度和精密度,就算是超过BP拖尾因子要求0.8 ~ 1.5 的系统适用性试验也是可以的。所以,系统适用性试验作为分析方法不可或缺的一部分,应该是结合分析方法本身一起来考虑。系统适用性要求应该是以满足分析方法检测为目的。


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  3.系统适用性试验的必要性

  USP40 收载的谷胱甘肽有关物质方法如下: 流动相以磷酸盐缓冲液( 取磷酸二氢钾6. 8 g 与庚烷磺酸钠2. 02 g,加水溶解并稀释至1000 mL,用磷酸调节pH值至2. 8) -甲醇( 970∶30); 色谱柱为USPL1; 检测波长为210nm; 柱温为30℃; 流速为使谷胱甘肽保留时间约为5min; 进样量为10μL。

  系统适用性溶液: 取谷胱甘肽对照品、抗坏血酸对照品和D-苯甘氨酸对照品各适量,加水溶解并稀释制成每1mL 中约含谷胱甘肽0. 5 mg、抗坏血酸0.5 mg 和D-苯甘氨酸0.1 mg 的混合溶液作为系统适用性试验溶液。

  系统适用性要求: 抗坏血酸与谷胱甘肽峰之间的分离度、谷胱甘肽与L-苯甘氨酸之间的分离度均不小于5,重复性不大于1.5%。 根据谷胱甘肽的分子结构,谷胱甘肽属于在C18柱保留较弱的化合物,所以出峰时间较早,USP40 方法流动相中采用了离子对试剂来增加保留,改善分离。然而,其保留时间也仅约为5min( 色谱柱规格:15cm × 4.6 mm,5 μm,L1) 。某厂家谷胱甘肽注册标准中,其他色谱条件与USP40基本一致,规定调节流速使谷胱甘肽保留时间约为2min。分析出现上述差异的原因,主要有以下几个方面: ①离子对试剂的质量差异。②流动相比例差异较大,由于操作而引入的系统误差。③不同批号、型号色谱柱对谷胱甘肽色谱保留行为的差异。④不同品牌仪器设备等造成的差异等。

  通过对谷胱甘肽分析方法的分析以及实际的操作可知,此分析方法是属于对试验条件较为敏感的方法。对于此类方法,可以对敏感的试验条件给予更加具体的规定。但对离子对试剂的来源、因流动相比例差异大引入的系统误差、不同品牌仪器等难以具体要求,即便色谱柱可以规定品牌和型号,但也会给后续的方法转移和样品检测带来了诸多不便。因此,谷胱甘肽有关物质方法也未对上述条件乃至色谱柱加以规定。基于上述诸多问题,谷胱甘肽有关物质方法开发者们最终采用规定系统适用性试验参数的办法来解决方法重复性的问题,最终方法的准确性和精密度得到验证,方法得以被USP收载。 本文从USP41按顺序查找了abacavirsulfate,abirateroneacetate,acebutololhydrochloride,acepromazinemaleate,acetaminophen,acetazolamide 和acetylcysteine的含量测定方法,上述含量测定方法均规定了系统适用性试验要求,具体见表1。


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  一般情况下,含量测定样品溶液浓度水平较高,含量测定方法耐用性较好。但由《美国药典》各项下实例可知,即便在这种情况下,绝大多数的含量测定方法仍然规定了系统适用性试验要求。由此可见,《美国药典》对分析方法的系统适用性试验尤为关注。 当一个分析方法建立后,它可能会被不同人员,在不同时间、不同实验室、不同情况下使用,可能会发生许多异常或偏差。因此,为了保证检测结果的准确性,需要研究者在方法开发初始,对上述情况作出一定的预判或者模拟,通过建立一系列的适用性参数来保证分析方法在任何情况下都有效。由此可见,对于分析方法而言,系统适用性试验非常的重要。


  4.总结与讨论

  系统适用性试验作为分析方法不可分割的一部分,已经被越来越多的监管机构所重视。国际药品认证合作组织( PIC/S) 在2007年颁布的制药QC实验室GMP检查指南中提出,进行GMP检查时涉及色谱方法系统适用性的检查包括: ①检查分析方法验证过程中,应涉及是否开发了系统适用性试验,并对每一项系统适用性试验的参数进行了定义,而且结果符合规定。②检查分析仪器的确认时,应考察是否完整定义了系统适用性试验及其可接受标准。在FDA网站上以“system suitability test warning letter”为主题词进行检索,可以找到不少因为未做系统适用性试验或者没有按照要求做而导致制药企业收到警告信的实例。

  目前国内对这方面的认识也在逐渐的提升,这从《中华人民共和国药典》2005 年版、2010 年版到2015年版的各论变化中可以体会到。但从目前国内整体的药物研发情况来看,分析方法开发者们对此还没有足够的认识。在大多数的自行开发的分析方法中,未结合分析方法验证情况有针对性地去探索系统适用性试验的要求。在有药典参考标准的情况下,对药典标准的系统适用性要求不够重视,仅仅将色谱条件拿来使用,或者随意更改、降低系统适用性要求,导致方法的重现性差,检测结果不准确。在这方面,药物分析工作者们急需提升观念,提高重视程度,加强研究。


  作者|李飞1,李云2,许真玉1,1CDE; 2 301医院第八医学中心小西天门诊部

  内容来源|中国新药杂志 2019 年 第 28 卷 第 6 期

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