药物中的杂质包括工艺杂质和降解杂质。

　　基于药物的结构、来源、工艺等特点，从整体上思考一类药物的杂质谱分析策略，是杂质谱控制的一个飞跃，对产品的质量控制具有更实际的意义。

　　1 杂质谱分析方法

　　如何明确药品中的杂质组成进而建立适宜的分析方法是杂质谱分析首先需要解决的问题。

　　在国内根据特定品种在药典标准中收载的具体杂质结构，结合文献报道结果，对已有杂质谱分析方法进行改进与优化，依然具有较好的实用性。

　　如对塞来昔布、盐酸西那卡塞、杆菌肽原料药、克霉唑乳膏和复方依折麦布瑞舒伐他汀钙片有关物质 HPLC分析方法的改进等。而根据原料合成及制剂工艺的特点，建立适宜的杂质谱分析方法，对生产工艺进行评价与控制则成为新的热点。

　　如对安塞曲匹、富马酸沃诺拉赞、呋布西林钠原料及盐酸伐地那非口腔崩解片有关物质的分析等。

　　药物稳定性实验作为确定药物中降解杂质的重要环节，强制降解试验作为预测药物长期稳定性的重要工具，可以了解药品的可能降解途径和降解产物等，进而指导建立杂质谱分析方法。

　　通过对稳定性实验方案的合理设计，不仅可以评价药物处方的合理性，确定产品的有效期、复验期和贮存条件等，满足监管的需要，且稳定性试验中产生的降解杂质还可以用于验证杂质谱分析方法的有效性。

　　如通过对氨曲南稳定性实验中 3 个新未知降解杂质的鉴定，建立了新的杂质控制方法 。利用强制降解试验还有助于在杂质谱分析中对杂质的结构进行确认，如利用强制降解试验分析利奈唑胺片、头孢拉定二水合物、紫杉醇及其注射液的杂质谱等。

　　此外，通过对不同厂家生产的注射用头孢西丁钠杂质谱及杂质降解途径异同的分析，并结合强力破坏试验对样品中主要杂质的来源和降解途径进行研究，可以更全面地了解产品的特性，进而完善药品质量标准。

　　在国家评价性抽验中，通过对市场中不同企业相同产品的杂质谱的系统比较，可以较好地掌握同品种药品制剂中杂质谱的组成等信息，进而建立理想的杂质谱分析方法。

　　如对多肽类药物醋酸奥曲肽原料及其制剂 、半合成抗生素依托红霉素片与醋酸麦迪霉素颗粒剂、化学药口服制剂普伐他汀钠及其制剂 、缬沙坦胶囊、非甾体抗炎药酮咯酸氨丁三醇注射液、顺铂注射剂和利多卡因气雾剂等有关物质分析方法的建立；而采用试验设计理念对复杂成分的样品如丙酸交沙霉素进行方法优化，可获得更理想的分离结果。

　　而对不同企业产品杂质谱的比较，可用以评价产品质量的差异，揭示生产工艺与杂质谱的相关性。

　　如对硫酸依替米星、注射用磺苄西林钠、和注射用头孢西丁钠等的质量评价。

　　将杂质谱分析与生产过程相关联，则可以更好地理解生产工艺与杂质谱的关系，进而实现精准地对关键生产工艺的控制。

　　如阿莫西林克拉维酸钾片剂杂质谱分析结果揭示，制剂过程中阿莫西林三水合物的脱水与阿莫西林闭环二聚体的产生呈正相关；

　　头孢拉定颗粒杂质谱分析结果揭示，对制粒前温湿度的控制是工艺控制的关键；

　　注射用盐酸甲氯芬酯杂质谱分析结果揭示，杂质 A 为水解杂质，主要由制剂冷冻干燥过程引入，杂质B和杂质C为醇解杂质，主要由原料药合成工艺引入，与工艺中使用的低级醇类有关。

　　而注射用氨苄西林钠氯唑西林钠杂质谱的差异主要与氨苄西林钠原料的生产工艺有关，冷冻干燥工艺的氨苄西林钠原料较溶媒结晶工艺产品更不稳定，制剂更易受温度等环境因素的影响。

　　选择适宜的手性色谱柱常规 HPLC 方法，对实际产品中的手性杂质进行分析，依然是药品质量控制的常用方法。

　　如采用硅胶表面涂布直链淀粉-三 (3,5-二 甲苯基氨基甲酸酯) 为填充剂的手性色谱柱，对替格瑞洛中异构体杂质、枸橼酸托法替尼原料及片剂中对映异构体杂质的测定等。

　　然而采用超临界流体色谱法对药物中对映异构体的分析是近年来的研究热点。

　　如对1,4-二氢吡啶类钙拮抗剂 (尼索地平、西尼地 平、普拉地平、阿折地平、盐酸马尼地平) 的手性拆分，对依折麦布及其R-对映体的手性拆分等。

　　对多肽类药物的杂质控制研究也受到关注。

　　如以多肽合成中的中间体、潜在副产物和降解产物等为研究对象，建立醋酸亮丙瑞林 (一种合成的线性九肽) 有关物质分析方法；采用 LC-MS 分析鲑降钙素注射液中的降解杂质；采用离子色谱对糖肽类药物中游离糖含量的分析等。

　　对氨基酸类、糖类和酯类等结构相对简单且不具有 UV 吸收的药物/辅料的杂质分析研究的进展较缓慢，虽然有采用超临界流体色谱质谱联用技术定性分析中/长链结构甘油三酯组成的报道，但主要研究仍采用 HPLC 紫外末端检测.

　　如测定门冬氨酸钾镁注射液中门冬氨酸的有关物质、盐酸氨基葡萄糖的有关物质等；如引入新分离机制的色谱系统如 HILIC 等，结合新型的检测器如CAD、NQAD等，有望促进该领域的发展。

　　对 β-内酰胺抗生素中聚合物的分析，目前中国药典收载的 Sephadex-G10 凝胶色谱系统已经无法满足现代质控的需要，而基于高效凝胶色谱技术方法的专属性也越来越受到挑战。

　　由于二维色谱技术的发展，利用柱切换技术可以方便地将凝胶色谱系统中的色谱峰在常规 HPLC 色谱系统中进行定位，结合 LCMS技术即可在杂质分析方法中将聚合物杂质作为特定杂质进行控制，这也将成为控制β-内酰胺抗生素聚合物的发展方向。

　　2 微量杂质结构解析

　　采用 LC-MS 技术对产品中的工艺杂质和降解产物等微量成分的结构特征进行分析，依然是目前识别杂质结构的主要方法，对同系物药物及杂质裂解规律的探讨有助于对杂质的识别。

　　而 NMR 技术及联用技术在杂质定性分析中的应用也越来越广泛。

　　国内近年来在对结构复杂且存在手性中心的未知杂质进行鉴别时，普遍采用制备分离，再利用各种波谱技术对其结构进行推测的策略。如对盐酸多西环素和利福拉齐杂质等的鉴别。

　　而利用高分辨质谱，根据一级、二级质谱裂解规律推测化学药品中杂质的结构已逐渐成为主流。

　　如对尼麦角林、碘海醇中有关物质 O-烷基化合物和 N-烷基化合物的准确分子量和结构推测，采用电喷雾离子化正负 2种离子模式鉴定达比加群酯中间体和瑞舒伐他汀中间体中的杂质，采用飞行时间质谱推测佐匹克隆、盐酸左西替利嗪片中的杂质结构；采用高分辨飞行时间质谱分析氯沙坦钾和创新药物艾托莫德中的未知杂质。

　　二维液相色谱-质谱联用技术则解决了色谱流动相不适宜直接用于质谱分析的难题。如用于分析来氟米特片的杂质谱和对咪达唑仑注射液中杂质结构的解析等。

　　3 微量/痕量杂质分析

　　对微量毒性杂质和 MIs 的分析近年来的发展较快。

　　沈雨婷等采用UPLC-MS/ MS 方法，测定了盐酸哌替啶原料及注射液中的神经毒性杂质 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶；栾绍嵘等利用离子色谱安培法检测维生素 B6 与 2-噻吩 乙酸中的氰化物；周婷等利用乙醇衍生顶空气相色谱法测定氢氯噻嗪原料药中微量甲醛和甲酸的含量；采用HPLC柱前衍生化法测定聚山梨酯类辅料中醛类物质。

　　对 MIs 的检测是当前国内的热点。

　　刘晓丹等对 MIs 在医药工业中的可能来源等进行了分析；张霁等对药物研发中 MIs 的控制策略与方法进行了综述；刘雪薇等综述了药物中磺酸酯类MIs的研究进展；谢含仪等对MIs分析方法和前处理技术的研究进展进行了综述。

　　虽然采用 HPLC-UV 方法有时可满足 MIs 常规质控的要求，如对利伐沙班、间苯三酚中苯胺类 MIs的分析等，

　　但为提高方法的灵敏度与准确性，更多的是采用 HPLC-MS 和 HPLC-MS/MS 方法，如对酒石酸伐尼克兰和氟胞嘧啶中痕量苯胺类MIs的测定；对硫酸氢氯吡格雷和草酸右旋西酞普兰中甲苯磺酸酯类MIs的测定；对奥拉帕尼中氨基甲酸酯类 MIs的测定；对阿哌沙班中的 3-吗啉基-1-[4-(5-氯戊酰胺基)苯基]-5,6-二氢吡啶-2(1H)- 酮 (2)、卡非佐米中的 (2S)-2-氨基-4-甲基-1-[(2R)-2- 甲基环氧乙烷基]-1-戊酮 (3)等 MIs 的测定。

　　然而，如何将针对具体品种的测定方法形成通用的检测/筛查平台是亟待思考的问题。

　　在元素杂质分析方面，徐文峰等综述了电感耦合等离子质谱 (ICP-MS) 在药物分析中的应用。采用微波消解-ICP-MS 法，可对蚓激酶 、盐酸安舒法辛缓释片中的多种有害元素同时进行测定。

　　ICP-MS 法还可同时测定玻璃类药包材中的多种迁移离子，有助于开展相容性及对玻璃药包材的质控。如注射用泮托拉唑钠在低硼硅玻璃管制注射剂瓶中，经强降解试验、加速试验和长期试验后，发现产品中的硅、钙有上升趋势，铝、硼也有一定程度的上升，镁、镉、铅、砷、锑迁移数值略有波动，但均明显低于 PDE 值要求；

　　采用 4% 的醋酸溶液对玻璃药包材进行浸提，测定浸提液中的 11 种元素杂质，发现铝的浸出量较高，澄清剂氧化铈应用广泛，建议对铝、铈的浸出量作为玻璃药包材的检测指标。

　　在对各类药品包装材料中浸出物/迁移物的分析方面，系统的研究尚较少见。

　　付蒙等采用 GC-MS 分析卤化丁基胶塞中的挥发性成分和可提取物信息，认为挥发性成分中的寡聚物和抗氧剂可以反映生胶的种类与来源，环硅氧烷类化合物可以体现不同胶塞的硅化工艺差异，其他挥发性成分如饱和烷烃类与胶塞具体配方有关，可提取物成分中的S8，可用于部分硫化体系的识别。

　　其他较多的研究集中在对各类残留物、添加剂，特别是抗氧剂迁移量的检测上。

　　如采用 GCMS/MS 测定一次性使用输液器产品中增塑剂偏苯三酸三辛酯 (TOTM) 的溶出量、采用 LC-MS/MS测定镀膜胶塞中全氟辛基磺酸 (PFOS) 和全氟辛酸 (PFOA) 的迁移、采用 GC 测定胶塞环硅氧烷类化合物的迁移及对三层共挤输液用袋、塑料输液包装材料与容器、药用丁基胶塞中的各类抗氧剂等的测定。

　　而利用 GC-MS 法在盐酸金霉素眼膏中发现多种多环芳烃和多种邻苯二甲酸酯，提示对凡士林辅料中的各类迁移物的控制势在必行。

　　4 杂质的毒性评估

　　对化学药品中毒性杂质的识别和判定一直是杂质安全性评价和限度控制的难点。

　　根据化学药品杂质毒性的性质，目前可将其分为3类：MIs，普通毒性杂质和普通杂质。

　　对MIs，使用杂质纯品，利用体外细菌致突变试验 (Ames 试验) 对其进行评估是理想的方法，

　　但鉴于实际应用中的困难，FDA 和欧洲药品管理局 (EMA) 等提出，在对杂质结构进行鉴定的基础上，可利用定量结构-活性关系 (QSAR) 模型，首先通过计算机预测杂质是否具有“警示结构”；

　　如果计算机预测该杂质不具有“警示结构”，则可判断该杂质不具有基因毒性；如果判断该杂质具有“警示结构”，则可通过 Ames实验进行试验确认，若 Ames实验结果为阳性，该杂质按 MIs控制；若为阴性，则判断其不具有基因毒性。

　　对非遗传毒性杂质，通常希望对其是否具有特定的毒性作用进行进一步的评估，以便在杂质谱控制中确定是否将其作为特定的毒性杂质进行控制。

　　利用计算机 (in silico) 预测杂质与 API 的 ADMET 特性的差异，对杂质的毒性作用进行评估是一种快速有效的方法，如对罗氟司特 (roflumilast)、盐酸头孢替胺 (cefotiam hydrochloride)诸降解杂质的评估。

　　近年来中国食品药品检定研究院与中国医学科学院医药生物技术研究所合作，完善了斑马鱼药物杂质毒性评价平台：

　　利用 LC-MS/MS 定量测定头孢菌素在斑马鱼体内的吸收情况，并进一步通过 QSAR 方法，建立了斑马鱼体内吸收与药物结构之间的定量关系模型，预测其他头孢菌素及杂质在斑马鱼体内的吸收情况；

　　利用胚胎毒性试验中的致畸率、致死率表征杂质的急性毒性，利用毒性表型的差异说明杂质毒性反应的差异；

　　利用幼鱼运动行为 (游动距离、游动速度、对光刺激的反应) 的改变，表征杂质对机体神经系统的作用；以幼鱼心跳速率的改变，结合对心脏发育畸形的观测，或成鱼心电图的改变表征杂质对心脏功能的影响；

　　在此基础上总结出头孢菌素结构与急性毒性、神经毒性、心脏毒性等的关系，成功地对国家创新药物头孢嗪咪钠中杂质的毒性进行了预测，形成了系统地对头孢菌素杂质毒性评价的策略与方法。此外，完成了对喹诺酮类药物结构与神经毒性等关系的探讨。

　　在此基础上，又将系统毒理学研究的策略和方法应用到对杂质的毒性评价中：通过生物信息学方法，筛选药物与杂质的差异表达基因 (DEGs) 和差异共表达基因 (CDEGs)；

　　构建药物-基因、药物-信号通路分子调控网络，探讨特定的靶器官毒性及作用机制；

　　构建蛋白-蛋白相互作用网络，寻找药物毒性作用的可能靶分子；

　　利用同源建模和分子对接技术，预测和模拟杂质与靶分子之间的相互作用。

　　完成了对C-7位含有氨噻肟结构的头孢菌素结构与神经毒性、心脏毒性的关系探讨，C-3 位含有巯甲基四氮唑结构的头孢菌素结构与胚胎毒性等的关系探讨；利用转录组技术结合拉曼成像，对头孢哌酮杂质的靶器官进行 了评价；

　　利用分子对接技术，对盐酸头孢替胺热异构化产生的两个同分异构体与HAS1靶蛋白的相互作用进行评价，进而预测它们的毒性效应。

　　为杂质谱 控制中评估药物杂质的毒性作用，进而制定合理的杂 质限度提供了解决方案。

　　需要进一步关注的问题

　　从药品注册的角度，关注杂质对药物安全性的影响依然是当前的重点。

　　鉴于对 MIs的关注，有必要对老品种原料药按照新的法规要求重新开展稳定性研究，对其中的降解杂质特别是挥发性降解杂质开展毒性评估，这对当前正在进行的药品一致性评价工作具有一定的指导作用。

　　然而，由于每一种 API 的合成平均需要6步反应，每一条合成路线平均需要用到4种反应 中间体；

　　在合成的最后步骤，烷基卤化物、酰氯 (acid chlorides)、芳香胺和迈克尔受体 (Michael acceptors) 是常用的4种反应中间体，对API中可能存在的MIs进行评估与合理的控制，而非一味地要求其不存在应是最适宜的质控策略。

　　在对药物降解产物进行基因毒性风险评估时，也不应仅根据计算机和/或基于理论预测的结果对许多尚未得到实验验证的假设降解产物进行调查，而应当重点关注那些在强制降解试验、加速或长期稳定性研究中观察到的降解途径和主要降解产物；

　　然而，目前对如何判断、预测和处理合成工艺中形成的MIs，虽然已经有许多个案报道，如对替尼类药物中的N-氧化物、硝基苯类物质催化氧化还原反应及副反应的控制、对过渡金属杂质的处理等，依然没有形成较统一的策略和方法，这已成为限制国内对MIs控制的瓶颈。

　　鉴于药物杂质的毒性反应被认为与干扰机体的正常反应通路 (pathway) 有明确的因果关系，使得利用体外模型在分子水平上探讨化合物的毒性反应机制，进而外推其可能在机体中的不良反应成为可能，并有望成为监管机构进行风险评估的新的实用工具。

　　这也将有望解决如何将药物/杂质毒理学信息与药物临床不良反应相关联，如何将不良反应信息与产品质量相关联等一直困惑杂质谱控制的难题。

　　来源：《药学学报》

　　作者：胡昌勤 ，张夏 (中国食品药品检定研究院）

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